本发明专利技术提供含有ATP7B基因表达框或其变异体的重组AAV载体。该AAV载体经静脉注射至肝豆状核变性模型小鼠体内，在肝脏中高效表达产生ATP7B或其变异体蛋白，有效地降低模型小鼠肝脏和尿液中的铜离子含量，显著降低模型小鼠血液中的谷丙转氨酶水平，缓解模型小鼠铜离子积累带来的不良症状，显示出治疗肝豆状核变性的潜力。
AAV vector carrying ATP7B gene expression frame and variants and its application
【技术实现步骤摘要】
携带ATP7B基因表达框及变异体的AAV载体及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及含有的ATP7B基因表达框及变异体的AAV载体，并将其应用于肝豆状核变性的基因治疗药物的开发。
技术介绍
肝豆状核变性又称Wilson病，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体单基因隐性遗传疾病，病变主要累及肝脏、脑、肾脏和角膜等部位，引起进行性加重的肝硬化、基底节损害、肾脏损害及角膜色素环等（KodamaH，etal.CurrDrugMetab.2012;13(3):237-250.）。肝豆状核变性由ATP7B基因突变引起，该基因编码铜转运P型ATP酶（copper-transportingP-typeATPase，ATP7B）。ATP7B是一种表达在多器官的膜蛋白，主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。当ATP7B基因发生突变时，ATP7B在细胞内的定位发生改变，其转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受阻。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。目前，肝豆状核变性的诊断主要依靠典型的临床表现、实验室检查及基因检测，治疗包括青霉胺、锌制剂和肝移植等。早期诊断和早期干预对于延缓疾病的进展和预防不可逆的后遗症至关重要。目前，肝豆状核变性的全球患病率大约为1/3万，在隔离人群（如撒丁岛）中，患病率可达1/1万（DedoussisGV,etal.AnnHumGenet.2005;69(3):268-274.GialluisiA,etal.EurJHumGenet.2013;21(11):1308-1311.），中国香港汉族患病率高达1/5400（MakCM,etal.JHumGenet.2008;53(1):55-63.）。虽然对于ATP7B基因突变导致肝豆状核变性的具体分子机制尚不完全清楚，但越来越多的证据表明ATP7B基因突变是导致肝豆状核变性的根本原因。ATP7B基因位于第13号染色体长臂（13q14.3～q21.1），全长约85kb，包含21个外显子和20个内含子，编码一种由1465个氨基酸组成的ATP7B。ATP7B属于跨膜蛋白，含6个N端金属结合域（N-terminalmetal-bindingdomain，MBD），每个金属结合域都含一段高度保守重复序列蛋氨酸-X-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸，8个跨膜通道（transmembranedomain，TM-区），1个ATP结合区（nucleotide-bindingdomain，N-区），1个磷酸化区（phosphorylationdomain，P-区），1个磷酸酶区（phosphatasedomain，A-区）（LutsenkoS,etal.ArchBiochemBiophys.2007;463(2):134-148.KumariN,etal.HumMutat.2018;39(12):1926-1941.）。MBD与铜有高亲和力，与抗氧化蛋白1（antioxidant-1，Atox-1）相互作用下接受来自细胞质的铜离子，并促进铜释放到跨膜孔道中（LenartowiczM,etal.FrontMolNeurosci.2016;9:68.）。MBD1～4主要调控其自身间的相互作用，MBD5～6是铜结合位点，能影响ATP7B蛋白的活性及催化能力（YuCH,etal.IUBMBLife.2017;69(4):226-235.）。半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列位于第6跨膜通道，可选择性通过金属铜离子（KumariN,etal.HumMutat.2018;39(12):1926-1941.）。如果ATP7B基因突变的残基是与ATP或铜的结合的关键位点，可能会引起ATP7B功能的完全丧失；如果突变只是影响对底物的亲和力、减缓构象转变或影响蛋白质的定位，ATP7B可能保留部分转运功能（HusterD,etal.Gastroenterology.2012;142(4):947-956.）。ATP7B是一种高度表达在肝细胞反式高尔基体网络的跨膜蛋白。铜主要在十二指肠吸收，通过高亲和力铜转运蛋白1参与肝肠循环。到达肝细胞后，铜和金属分子伴侣Atox-1结合并形成复合物，然后与ATP7B以蛋白-蛋白的形式相互作用。铜在ATP7B作用下被转运至反式高尔基体网络，并与相关的酶结合，形成血清铜蓝蛋白，随血液代谢；当肝细胞内的铜离子水平升高至一定程度时，ATP7B从反式高尔基体网络转运至溶酶体，将过量的铜运输到囊泡，铜经胞吐作用随胆汁排泄（PolishchukEV,etal.DevCell.2014;29(6):686-700）。在这一过程中，ATP7B借助ATP水解释放的能量磷酸化，随后脱磷酸化释放铜跨膜所需的能量。因此，ATP7B依赖性胆汁铜排泄是维持铜代谢平衡的主要方式。肝豆状核变性ATP7B基因突变类型多样，目前人类基因突变数据库已收录780种ATP7B基因突变，包括491种错义/无义突变、65种剪切位点突变、187种小缺失/插入突变、12种大片段缺失。突变可能发生在基因的任何位置，包括外显子、内含子，甚至是启动子区域。ATP7B基因突变在不同种族和地域中存在遗传异质性。欧洲人群最常见的突变类型是14号外显子上的H1069Q突变，在意大利、瑞典和罗马尼亚等地多见，等位基因频率为30%～70%（ZarinaA,etal.MolGenetGenomicMed.2017;5(4):405-409.FerenciP,etal.HumGenet.2006;120(2):151-159.），临床主要以锥体外系症状为主，如震颤、肌张力障碍、精神症状等。亚洲人群最常见的突变类型是8号外显子上的错义突变R778L，以中国、韩国和日本最多见，其等位基因频率为17.3%～60%（DongY,etal.Theranostics.2016;6(5):638-649.），临床以肝脏方面症状为主，如肝功能异常、肝硬化、肝脾大等；其余常见的还有P992L、Q1399R等。不同区域发生突变的概率不同。①MBD区（与1～6号外显子相关）：目前已报道位于该区的错义突变有18种，如位于MBD1的G85V，该突变抑制ATP7B与Atox-1的相互作用，影响蛋白和铜的结合（YuCH,etal.SciRep.2018;8(1):581.）；②半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸跨膜转运区（与7～10、12、13号外显子相关）：目前报道有103种突变，如R778L、G937S，该区突变主要通过改变蛋白的定位影响其功能（YuCH,etal.SciRep.2018;8(1):581.）；③A-区（与11号外显子相关）：目前发现有22种突变，该区域突变可导致ATP7B超磷酸化，引起催化活性的丧失（YuCH,etal.SciRep.2018;8(1):581.）；④P-区（与14～16号外显子相关）：有47种突变，如I1148T；⑤N-区（与17～18号外显子相关）：有超过55种突变，该区突变和P-区一起影响蛋白和ATP的结合，造成功能缺失（YuCH,etal.SciRep.2018;8(1):581.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人为设计的基因表达单元，其特征在于，包括：/n（1）肝脏特异性启动子，其序列信息如SEQ ID NO.1所示；/n（2）人源表达优化的人ATP7B编码序列或截短的人ATP7B编码序列，其序列信息如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示；和/或/n（3）多聚腺苷酸加尾信号，其中一种选择序列信息如SEQ ID NO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.人为设计的基因表达单元，其特征在于，包括：
（1）肝脏特异性启动子，其序列信息如SEQIDNO.1所示；
（2）人源表达优化的人ATP7B编码序列或截短的人ATP7B编码序列，其序列信息如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示；和/或
（3）多聚腺苷酸加尾信号，其中一种选择序列信息如SEQIDNO.2所示。
2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因序列。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：
（1）体内转导可表达产生人ATP7B蛋白或截短的人ATP7B蛋白；和/或
（2）重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV2...
【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，吴小兵，马思思，
申请(专利权)人：北京锦篮基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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