双靶向融合蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞表面分子DEC205的双靶向融合蛋白CFmDEC，以及利用多靶点抗肾癌复合抗原基因片段sig-tG250-Fc-IRES-GM-CSF-B7.1(25)，以5型复制缺陷性腺病毒为载体构建了抗肾细胞癌腺病毒疫苗—Ad5-tG250FcGB。该双靶向融合蛋白CFmDEC可增强肾细胞癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB的抗肿瘤效应，有效结合腺病毒并提高腺病毒疫苗靶向DCs的能力，在体内能够诱导更高的特异性抗肿瘤免疫反应，抑制肾细胞癌的生长。

【技术实现步骤摘要】
双靶向融合蛋白及其编码基因与应用
本专利技术属于生物制药领域，涉及一种融合蛋白，特别涉及一种可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205的双靶向融合蛋白(CFmDEC)及其编码基因与其在增强腺病毒疫苗免疫活性中的应用。
技术介绍
一、肿瘤基因疫苗的研究进展肿瘤免疫治疗概念的提出是建立在人体免疫系统能够将肿瘤细胞从正常细胞中识别，从而影响肿瘤细胞的生长。有证据显示免疫系统对肿瘤细胞的耐受是不完全的，对肿瘤细胞自发免疫反应的强度和范围与肿瘤预后及生存时间存在相关性。然而，抗肿瘤免疫反应通常会被肿瘤微环境中的免疫抑制反应影响，这两种反应相互制约，如何使抗肿瘤免疫反应压倒免疫抑制反应是利用肿瘤免疫治疗发挥作用的关键。尽管在过去十几年做了大量工作，但多项临床试验效果并不理想，肿瘤疫苗一直无法转化至有效的临床产品。近来情况好转，一些研究在人体试验上取得了一定的临床效果，并且有部分产品已经注册。在众多肿瘤疫苗中，基因疫苗近年来发展迅速，相关技术平台比较完善，在肿瘤和感染性疾病等免疫治疗领域中显示出一定的地位。基因疫苗是利用病毒或质粒为载体，将编码抗原片段基因克隆至载体，在体内表达目的抗原，诱导机体产生免疫应答。基因疫苗由体细胞吸收后，可以内源性表达目的抗原。基因疫苗有以下几项优点：1)能够诱导细胞因子高水平表达，进而募集并激活DCs；2)通过表达专职APCs抗原(是指抗原递呈细胞)，可以通过MHCI类途径(是指I类抗原递呈途径)诱导CD8阳性T细胞反应(是指特异性细胞杀伤反应)，从而特异性杀伤肿瘤细胞；3)可以将靶抗原的多个表位同时作为靶点，而无需MHCI类限制；4)可以将抗原设计至更具免疫原性，或共递送多种抗原；5)很容易形成融合基因，形成Th记忆反应(是指辅助性T细胞反应)，从而产生免疫记忆。综合各种优势，相信基因疫苗将在抗肿瘤免疫治疗中发挥有效而强大的作用。1DNA疫苗将编码目的抗原的质粒DNA通过皮内或肌肉注射，是一种简单而有效的诱导免疫反应的治疗方法。DNA质粒载体含有一个基因读码框，读码框通常由载体内的启动子控制(如巨细胞病毒增强启动子CMV)。DNA注入体内后必须由细胞摄取，进入细胞核并以转录激活形式存在；最终基因表达量与转染的细胞数量成正比。诱导靶抗原相关免疫反应的前提包括以下几点：1)摄入质粒的细胞能够产生目的抗原，以分泌形式或膜表达形式输出；2)抗原在引流淋巴结由宿主专职APCs处理并交叉递呈。但是也有一些条件限制质粒DNA发挥作用：1)能够进入细胞并定位于细胞核的质粒DNA很少；2)组织内APC周围缺乏炎症反应条件，以及缺乏激活T细胞活化等共刺激分子的表达。因此，单纯裸质粒DNA注射通常效果不佳，尤其是在从小物种(小鼠、大鼠)到灵长类、人的试验中得到证实。单纯的DNA疫苗在人体实验中虽然剂量加大，但仍不能诱导有效的免疫反应，其中原因仍不明了，不排除大物种和小物种骨骼肌结构差异的影响。总而言之，可以这样认为，低效的DNA质粒递送方式和低水平的抗原表达量，以及缺乏内生免疫系统刺激，一同导致了DNA疫苗效果不佳。因此，有必要进一步优化DNA疫苗策略。为了能更好的发挥DNA疫苗作用，剂量、时间、佐剂、递送方式以及给药途径等各种因素都必须综合考虑。其中一种有效的方法是将质粒与脂质体混合，直接瘤内注射以提高DNA摄入量。Vical公司利用该方法设计出肿瘤疫苗Allovectin-7，将编码HLA-B7和β2微球蛋白的DNA序列装载成为一个功能性MHCI类分子复合物。瘤内注射后，MHCI复合物展示在肿瘤细胞表面，并通过下列方式增加抗肿瘤免疫反应：1)DNA-脂质体诱导炎症反应；2)MHCI增强肿瘤抗原呈递；3)宿主识别新生的MHCI为外源分子，产生异源反应。在针对III/IV期黑色素瘤病人的Allovectin-7Ⅲ期临床试验中已经证明，与当前一线化疗相比其临床效果具有明显优势。另外一种方法是直接将编码肿瘤抗原片段的质粒DNA注射进淋巴结，以提高DNA的暴露率，增加专职抗原递呈细胞对其的摄取，其机制可能是淋巴结内注射质粒有利于局部炎症反应、产生适当的细胞因子环境以及上调免疫应答所需的共刺激分子。2DNA电脉冲(DNA-EGT)质粒DNA体内电脉冲是一种安全的递送方式，可以提高细胞对DNA的摄取，增加蛋白表达量并延长免疫反应时间。电脉冲的原理是利用短暂的电脉冲使细胞膜瞬时通透性增加，大分子物质如DNA或RNA可以进入胞质内[17]。此外，组织内的电势梯度允许细胞核内转导DNA分子的输送。随后电脉冲停止，细胞膜上裂隙封闭，而不会导致细胞死亡。电转化的脉冲时间一般是毫秒或微秒级的。电脉冲不仅可以增加目的基因表达，同时还可在注射位点提高炎性化学因子和细胞因子的分泌，营造炎性环境并募集APCs，最终输送至引流淋巴结，因而可以增强免疫反应。所以，电脉冲介导的质粒DNA递送比普通肌肉内注射能诱发更强的抗原特异性体液及细胞免疫反应。DNA-EGT技术在一项治疗前列腺癌的I期临床试验中显示出可喜的结果，病人不仅安全耐受，同时可以诱导出比单纯注射DNA疫苗组高的免疫学反应。VGX-3100TM同样是利用EGT技术的DNA疫苗，目前其针对宫颈癌患者的II期临床研究正在进行。该疫苗质粒编码HPV病毒E6和E7抗原，在其I期临床试验中受者是CIN2/3期术后患者，在用VGX-3100TM治疗的18人中，13人出现了明显的T细胞反应，阳性反应中百万细胞里出现100至5000斑点。亚组分析显示83％(5/6)出现强烈的T细胞反应，另外15/18中发展了至少一个抗体反应。另一个正在进行的I/II期临床试验药物是V934/V935，该疫苗是由默克和Inovio/Geron公司共同开发，针对靶点是人端粒酶(hTERT)，同时该疫苗策略利用Prime/boost(初免/增强)技术。3RNA疫苗用编码肿瘤抗原的质粒DNA直接注射DNA转录产物mRNA，即RNA疫苗。Cure-Vac公司应用该方法使mRNA疫苗与精蛋白混合后皮内注射。该mRNA疫苗技术是通过与质粒DNA一样的作用机制来诱导抗原表达和免疫刺激。动物模型中，仅仅两次皮内注射RNA疫苗就可以观察到抗原特异性CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞等全身免疫反应。同时，还在肿瘤内检测到多种与疫苗相关的T/NK细胞激活以及瘤内免疫细胞浸润。基于该平台，Cure-Vac公司研制了分别针对前列腺癌和肺癌的两种RNA疫苗CV9103和CV9201(www.curevac.com)。I/IIa期临床试验证实疫苗安全，病人可以耐受，而且在大部分病人体内可以检测到至少一种抗原特异性T细胞反应。4病毒载体病毒载体是通过将抗原编码片段插入到病毒基因组中，进而表达相应目的抗原。病毒载体制备需要转染质粒提供反向缺失病毒基因，或者专门利用一种包装细胞，该细胞株基因组已经被稳定插入可以复制和包装病毒的基因。重组病毒纯化定量后可以感染宿主细胞，表达靶抗原并呈递至免疫系统。理想的病毒载体应该能有效的将表达的目的抗原呈递至免疫系统，而病毒本身的免疫原性较低。同时，在致病潜能、病毒繁殖、传染性及病毒残留方面还要有安全保证。4.1痘病毒载体疫苗将肿瘤抗原基因序列插入到在哺乳动物体内无复本文档来自技高网...

【技术保护点】
可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)表面分子DEC205的双靶向融合蛋白，命名为CFmDEC，是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的序列9；2)将序列表中序列9的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DCs)表面分子DEC205作用的蛋白质，新蛋白质与序列9同源性达到80％或更高。

【技术特征摘要】
2014.05.13 CN 20141020039831.可以介导5型腺病毒载体特异性结合树突状细胞(DendriticCells，DCs)表面分子DEC205的双靶向融合蛋白，命名为CFmDEC，其氨基酸残基序列如序列表中的序列9所示。2.权利要求1所述双靶向融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列为：1)序列表中序列8的DNA序列；或2)编码序列表中序列9的DNA序列。3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。4.一种表达权利要求1所述双靶向融合蛋白CFmDEC的方法，包括以下步骤：1)构建重组表达载体：将权利要求2所述编码基因连接入载体pGEX-6P-1中，得到重组表达载体，命名为pGEX-CFmDEC，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；2)表达双靶向融合蛋白CFmDEC：将重组表达载体pGEX-CFmDEC转化或转导宿主细胞及其后代细胞，发酵重组宿主细胞，使所述编码基因获得表达，得到双靶向融合蛋白CFmDEC。5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述步骤2)中的宿主为可表达外源基因的原核细胞；所述原核细胞为以下大肠肝菌：E.coliBL21、E.coliRosetta、E.coliOrigami、E.coliM15、E.coliJM109、或E.coliLG90；所述步骤2)中培养含有所述编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：于继云，阎瑾琦，王宇，田仁礼，殷小涛，武帅，朱晓明，王籽橙，杜芝燕，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11