本发明专利技术公开了一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质。在氧化型辅酶存在的情况下，采用本发明专利技术所提供的蛋白质可体外降解棒曲霉素，且效果非常好。本发明专利技术所提供的蛋白质在清除棒曲霉素方面具有重要应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物领域，涉及一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
棒曲霉素(Patulin)是部分青霉属和曲霉属真菌的次生代谢产物。它对人及动物具有广泛而强烈的毒性作用。急性毒性表现为抽搐、痉挛、皮下组织水肿、肺肠充血、肠炎、无尿直至死亡；慢性毒性可导致胃溃疡，并具有抑制免疫、致畸性以及潜在的致癌性等，还有可能影响男性的生育能力。棒曲霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性条件下化学性质稳定。在具有棒曲霉素产生能力的真菌中，部分真菌是植物致病菌，其中最主要的一种是扩展青霉病菌(Penicillium expansum)。这种病原菌是世界范围内引起果实采后腐烂的最重要的病原菌之一，常见的寄主包括苹果、梨、葡萄、樱桃、桃、草莓等等。它在引起果实腐烂的同时，会向果实组织中分泌大量的棒曲霉素。在果汁加工产业中，如果腐烂的果实混入原材料中，那么生产出的果汁就会有不同程度的棒曲霉素残留，给消费者(特别是儿童)的身体健康带来危害。基于棒曲霉素对人体健康的潜在危害，世界上很多国家都对果汁产品中棒曲霉素的最大限量做了规定，EU、USFDA规定果汁产品中棒曲霉素的最大限量为50μg/kg，WHO建议人每天棒曲霉素的摄入量不超过0.4μg/kg体重。目前，主要通过吸附、微波处理等物理手段进行去除棒曲霉素，但效果不是十分理想，亟需研发新型的降解棒曲霉素的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种降解棒曲霉素的蛋白及其编码基因与应用。本专利技术所提供的蛋白质，命名为Cgscd，来源于季也蒙假丝酵母菌(Candida guilliermondii)，具体是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质。为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。在本专利技术中，所述蛋白质具体为将pET-30a(+)载体的多克隆位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重组载体所表达的蛋白质。该蛋白质的N端有6×His标签。编码所述蛋白质的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。在本专利技术的一个实施例中，所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因(命名为Cgscd)，所述基因为如下1)-3)中任一的DNA分子：1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本专利技术中，所述重组载体具体为将pET-30a(+)载体的多克隆位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的重组载体(命名为pET30a(+)-Cgscd)。在本专利技术中，所述重组微生物具体为导入了所述重组载体pET30a(+)-Cgscd的大肠杆菌BL21(DE3)。所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：(a)降解棒曲霉素；(b)制备具有降解棒曲霉素功能的产品。本专利技术还提供了一种降解棒曲霉素的方法。本专利技术所提供的降解棒曲霉素的方法，具体可包括如下步骤：在氧化型辅酶存在的情况下，采用所述蛋白质体外催化棒曲霉素的降解反应。在所述方法中，所述降解反应的温度可为25-30℃(如25℃)，pH可为4-6(如6)，时间可为12-24h(如12h)。所述降解反应的反应体系中所述氧化型辅酶的浓度具体可为2-5mM(如2.1mM)。所述降解反应的反应体系中所述蛋白质与待降解的棒曲霉素的质量比具体可为12:5。进一步，所述降解反应的反应体系中所述蛋白质的浓度具体可为60μg/mL；所述降解反应的反应体系中所述待降解的棒曲霉素的浓度具体可为25μg/mL。在所述方法中，进行所述降解反应时，最好将所述反应体系置于摇床上振荡，具体转速可为120-200rpm(如120rpm)。本专利技术还提供了一种具有降解棒曲霉素功能的产品。本专利技术所提供的具有降解棒曲霉素功能的产品，其活性成分为所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。根据需要，所述产品中还可含有氧化型辅酶。在本专利技术中，所述氧化型辅酶具体可为氧化型辅酶I(NAD+)或氧化型辅酶II(NADP+)。实验证明，在氧化型辅酶存在的情况下，采用本专利技术所提供的Cgscd蛋白(序列1)可体外降解棒曲霉素，且效果非常好。本专利技术所提供的Cgscd蛋白(序列1)在清除棒曲霉素方面具有重要应用价值。附图说明图1为Cgscd基因克隆的PCR产物检测结果及菌液PCR检测结果。其中，A为PCR产物检测结果；B为菌液PCR检测结果(泳道1-6为阳性转化菌株)。图2为Cgscd重组蛋白的原核表达结果。1，3：pET-30a(+)上清和包涵体；2，4：pET-30a(+)-Cgscd上清和包涵体。图3为Cgscd重组蛋白的镍柱亲和纯化结果。1：载入蛋白；2：贯穿蛋白；3-4：洗涤液；5-8：洗脱液。图4为不同辅酶对Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影响。*p＜0.05。图5为不同pH对Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影响。*p＜0.05。图6为不同温度对Cgscd蛋白降解棒曲霉素的影响。*p＜0.05。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、Cgscd基因的克隆及Cgscd蛋白的原核表达一、Cgscd基因的克隆根据Cgscd蛋白(gi|190348612，Short-chain dehydrogenase)的GI号在NCBI中查找对应的Cgscd基因序列，在该基因两端设计引物并在引物上增加BamHI和XhoI两个酶切位点，分别命名为pET-30a-F(BamHI)和pET-30a-R(XhoI)。pET-30a-F(BamHI)：5’-GGATCCATGGAACAAACGTACTTTATTTCAGGCG-3’；pET-30a-R(XhoI)：5’-CTCGAGTTACCATGGAAGTTCGGTTCCATCG-3’。以季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)CGMCC 2.63(记载于“Yuanyuan Zong,Jia Liu,Bo本文档来自技高网...
【技术保护点】
蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-3)中任一的DNA分子：1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码具有降解棒曲霉素功能的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。5.权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：田世平，李博强，张占全，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。