植物Cas9变体蛋白VQR及其编码基因与应用制造技术

技术编号:13240764 阅读:124 留言:0更新日期:2016-05-15 02:19
本发明专利技术公开了一种植物Cas9变体蛋白VQR,该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明专利技术还同时公开了植物Cas9变体基因VQR,该基因编码植物Cas9变体蛋白VQR,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还同时公开了包含上述基因的重组表达载体。本发明专利技术的植物Cas9变体蛋白VQR的用途是:能够在PAM区为5’-NGA-3’的情况下实现基因组编辑功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
,是对植物基因进行编辑的Cas9蛋白变体VQR及其编码基因的应用。
技术介绍
近年来,CRISPR-Cas9以其高效、简便的技术特点,在植物中迅速成为最为重要的基因组编辑手段。CRISPR-Cas原为广泛分布存在于原核生物中的免疫系统,CRISPRs(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)即规律成簇间隔短回文重复,Cas蛋白则是一种受RNA引导的核酸酶。目前所使用的CRISPR-Cas9系统,是基于II型CRISPR-Cas所开发的基因组编辑技术。该技术所涉及到的Cas蛋白仅有Cas9一种,受tracrRNA和crRNA组成的引导RNA(后被优化为sgRNA)所引导,Cas9蛋白的HNH结构域及RuvC结构域在PAMs(protospaceradjacentmotifs)序列上游的3-8bp处进行双链切割并造成双链断裂。当双链断裂发生,细胞便会启动两套修复机制,即非同源末端链接(Non-homologousending-joining,NHEJ)与同源重组(Homologousrecombination,HR)。非同源末端链接通常造成双链断裂处产生单个或多个碱基的缺失、插入,以该方式修复的个体常常产生某个基因的定点突变。同源重组则是以同源序列作为模板,进行高保真修复。在CRISPR/Cas9系统中,前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif,PAM)序列决定了整个基因组中靶序列的分布。PAM是位于目标DNA附近的一段序列,具有识别靶DNA的功能,只有当正确结合PAM序列时,才能活化Cas9的两个内切酶活性区。靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点,是实现剪切功能的关键。然而这并不能完全满足人们对于植物基因编辑范围的需求。由于CRISPR-Cas9系统靶位点的选择受到PAM序列NGG的限制,因此在植物中发现及改造能识别新PAM的Cas9变体变得十分重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新型植物Cas9变体蛋白VQR及其编码基因和应用。为了解决上述技术问题,本专利技术提供一种植物Cas9变体蛋白VQR,该蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。作为本专利技术的植物Cas9变体蛋白VQR的改进:所述蛋白质还包括在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。本专利技术还同时提供了一种植物Cas9变体基因VQR,该基因编码植物Cas9变体蛋白VQR,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。作为本专利技术的植物Cas9变体基因VQR的改进:所述基因还包括在SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。本专利技术还同时提供了一种重组表达载体,包含上述基因。本专利技术还同时提供了上述植物Cas9变体蛋白VQR的用途,其特征是:能够在PAM区为5’-NGA-3’的情况下实现基因组编辑功能。N代表A,T,C,G任意一种核苷酸。本专利技术的方案具体如下:本专利技术提供的蛋白,是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性功能由序列2衍生的蛋白质。上述蛋白中,一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白的基因也是本专利技术保护的范围。上述基因是如下(1)-(3)中任一所述的DNA分子:1)序列表中序列1的DNA序列;2)编码序列表中序列2蛋白质序列的多核苷酸;3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列;含有以上任一所述基因的重组载体也属于本专利技术的保护范围,如重组表达载体。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在编辑植物基因组中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术经对编码Cas9的基因进行突变,产生一种编码新型Cas9变体蛋白VQR的基因,识别的PAM为NGA。在水稻以NGA为PAM序列筛选靶位点并编辑GL1-1等基因的实验中,经转基因手段,成功得到GL1-1等功能缺失的突变体植株,表明该蛋白能够识别5‘-NGA作为PAM序列并对靶位点进行编辑。本专利技术在扩大植物基因编辑范围上有广阔的应用前景。本专利技术的用途是:用于对植物基因组特定的靶位点进行基因编辑,即PAM区为5’-NGA-3’的靶位点。作为基因编辑技术CRISPR-Cas9系统中的一员,相较于传统Cas9蛋白只能编辑PAM区为5’-NGG-3’的靶位点的限制,扩大了该系统在植物基因组中可编辑的范围。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为重组载体部分元件及突变位点示意图。图2为GL1-1靶位点酶切检测结果;M为marker;6,10,15,17为敲除杂合体植株;最后两个泳道分别为酶切和未经酶切的野生型;其余泳道则为敲除阴性植株,酶切结果与酶切的野生型无异。图3为GL1-1靶位点测序结果;下划波浪线标示的为靶位点;单下划线标示的为PAM序列;框标示的为酶切识别位点;缺失以短横杠表示,插入以小写字母表示。图4为野生型中花11及突变体GL1-1的表型。图5为NAL1靶位点测序结果;下划波浪线标示的为靶位点;单下划线标示的为PAM序列;框标示的为酶切识别位点;缺失以短横杠表示,插入以小写字母表示。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1、Cas9变体VQR的获得通过重叠延伸PCR技术将突变引入Cas9编码基因中的特定位点。需将完整的Cas9以1135位的氨基酸和1336位氨基酸处为界,分为3段,再通过PCR将其编码序列扩出。所使用的引物如表1所示;KODFXDNA聚合酶(购自东洋纺生物科技有限公司)PCR扩增目的条带,反应条件如下:备注本文档来自技高网
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【技术保护点】
植物Cas9变体蛋白VQR,其特征是:该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

【技术特征摘要】
1.植物Cas9变体蛋白VQR,其特征是:该蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
2.植物Cas9变体蛋白VQR,其特征是:所述蛋白质还包括在SEQIDNO:2所示的氨基酸
序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
3.植物Cas9变体基因VQR,其特征是:该基因编码植物Cas9变体蛋白VQR,所述基因的核
苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

【专利技术属性】
技术研发人员:王克剑胡熙璕王春付亚萍刘庆焦晓真
申请(专利权)人:中国水稻研究所
类型:发明
国别省市:浙江;33

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