人源化抗HAdV-B7单克隆中和抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人源化抗HAdV

【技术实现步骤摘要】
人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]HAdV是常见的呼吸道病毒，其感染所致的重症肺炎是儿童致死、致残的重要原因之一。据文献报道，重症肺炎患儿中高达13.3%为HAdV感染所致。B种HAdV是HAdV重症肺炎患儿感染的最主要型别，其中，B种HAdV 7型（HAdV
‑
B7）感染更容易引起儿重症肺炎并伴随较高的病死率。目前尚无有效的方法用于预防和治疗HAdV肺炎。广谱抗病毒药物西多福韦对早期HAdV感染有一定的疗效，但对HAdV肺炎疗效并不明显。国外学者尝试寻找新的抗HAdV化学药物，但尚未取得重大突破。
[0003]抗病毒单克隆中和抗体凭借特异性高和抗病毒效果显著的特点，在病毒的预防和治疗方面发挥着重要的作用，同时，给HAdV感染的防治带来了希望。目前，已有报道的抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体均为鼠源抗体。实践证明，鼠源抗体进入人体后，引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体（human anti
‑
mouse antibody，HAMA）反应，可使鼠源抗体加速被清除，甚至引起过敏性休克，因而被淘汰。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种能够解决鼠源抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体引起人体免疫排斥反应的问题的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体、制备方法及其应用。
[0005]一种人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]在其中一些实施例中，所述重链可变区包括重链互补决定区以及重链骨架区；其中，所述重链互补决定区包括：SEQ ID NO.3所示的重链CDR1、SEQ ID NO.4所示的重链CDR2和SEQ ID NO.5所示的重链CDR3；所述重链骨架区包括SEQ ID NO.6所示的重链FR1、SEQ ID NO.7所示的重链FR2、SEQ ID NO.8所示的重链FR3和SEQ ID NO.9所示的重链FR4。
[0007]在其中一些实施例中，所述轻链可变区包括轻链互补决定区以及轻链骨架区；其中，所述轻链互补决定区包括：SEQ ID NO.10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.11所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.12所示的轻链CDR3；所述轻链骨架区包括SEQ ID NO.13所示的轻链FR1、SEQ ID NO.14所示的轻链FR2、SEQ ID NO.15所示的轻链FR3和SEQ ID NO.16所示的轻链FR4。
[0008]在其中一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
[0009]在其中一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
[0010]本专利技术的目的之一还在于提供了一种核酸分子。
[0011]一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
[0012]本专利技术的目的之一还在于提供了一种重组载体。
[0013]一种重组载体，所述重组载体含有所述的核酸分子。
[0014]本专利技术的目的之一还在于提供了一种重组载体的制备方法。
[0015]一种所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：（1）杂交瘤细胞的复苏与培养应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染，然后检测嵌合抗体抗HAdV
‑
B7的中和活性；（5）嵌合抗体的表达与纯化分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；（6）检测嵌合抗体的中和活性（7）人源化改造确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。
[0016]本专利技术的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
[0017]一种重组细胞，所述重组细胞表达所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，本专利技术的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
[0018]一种重组细胞，所述重组细胞的基因组中整合有所述的核酸分子。
[0019]本专利技术的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
[0020]一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的重组载体。
[0021]本专利技术的目的之一还在于提供了一种重组细胞的制备方法。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，其特征在于，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，其特征在于， 所述重链可变区包括重链互补决定区以及重链骨架区；其中，所述重链互补决定区包括：SEQ ID NO.3所示的重链CDR1、SEQ ID NO.4所示的重链CDR2和SEQ ID NO.5所示的重链CDR3；所述重链骨架区包括SEQ ID NO.6所示的重链FR1、SEQ ID NO.7所示的重链FR2、SEQ ID NO.8所示的重链FR3和SEQ ID NO.9所示的重链FR4。3.根据权利要求1所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，其特征在于， 所述轻链可变区包括轻链互补决定区以及轻链骨架区；其中，所述轻链互补决定区包括：SEQ ID NO.10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO.11所示的轻链CDR2和SEQ ID NO.12所示的轻链CDR3；所述轻链骨架区包括SEQ ID NO.13所示的轻链FR1、SEQ ID NO.14所示的轻链FR2、SEQ ID NO.15所示的轻链FR3和SEQ ID NO.16所示的轻链FR4。4.根据权利要求1
‑
3任意一项所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。5.根据权利要求1
‑
3任意一项所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1
‑
5任意一项所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区。7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求6所述的核酸分子。8.一种权利要求7所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）杂交瘤细胞的复苏与培养应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体的杂交瘤细胞，对其进行扩大培养；（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增（2.1）RNA提取：提取杂交瘤细胞的总RNA；（2.2）反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA；（2.3）PCR扩增：以合成的cDNA为模板，分别 PCR扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染细胞，收集细胞培养上清，检测嵌合抗体抗HAdV
‑
B7的中和活性；（5）嵌合抗体的表达与纯化
分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩后测定嵌合抗体的浓度；（6）检测嵌合抗体的中和活性（7）人源化改造确定鼠源抗体重链可变区的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，以人源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链FR1、重链FR2、重链FR3和重链FR4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3和轻链FR4，构建人源化抗体轻链可变区；按照CHO细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体，人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体与人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1
‑
5任意一项所述的人源化抗HAdV
‑
B7单克隆中和抗体。10.一种重组细胞，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振卫，周荣，冼钰婷，田新贵，李潇，陈伟略，刘铭龙，
申请(专利权)人：广州呼研所医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：