一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的方法，特别是对中国东北种群和华北种群进行鉴别。本发明专利技术依据黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I(COI)和线粒体NADH脱氢酶亚基4(ND4)两个基因片段分别设计特异性引物，引物序列分别如SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.3‑4所示,以待鉴别物种基因组DNA为模板，进行PCR，将PCR扩增产物进行串联比对，从而实现对我国黑唇苜蓿盲蝽东北种群和华北种群的鉴定。本发明专利技术方法简单可靠，灵敏度高、特异性强，耗时短、可操作性强，稳定性好，可重复性强，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法
本专利技术涉及分子标记检测
，特别是涉及利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法，以及鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的特异性引物组合。
技术介绍
黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)属于半翅目(Hemiptera)盲蝽科(Miridae)苜蓿盲蝽属(Adelphocoris)，为一种棉田害虫，植食性，成虫常见于葎草、马铃薯、十字花科等寄主植物上，分布范围较广，北至黑龙江，南至贵州等地均有其分布。在调查过程中，申请人发现在中国的东北地区，例如辽宁、黑龙江等地；华北的河南、河北、山东、北京等地该种的种群数量较大；宁夏、贵州等地虽有该种的分布但种群数量相对较少。虽有相关研究显示该种体色变异较大，淡色个体近黄褐色，深色个体近黑色，南方个体一般色深，但是仅通过外部形态特征鉴别不同地区种群个体，即使是专业的技术人员在鉴别的过程中也会存在一定的主观性且很难准确的进行鉴别。快速有效地对黑唇苜蓿盲蝽东北和华北地区种群进行鉴别，可以针对不同种群合理用药，从而有效地减少黑唇苜蓿盲蝽对作物的危害。遗传分析结果显示：东北地区种群遗传多样性低于华北地区种群，因此在对不同地区种群进行药剂防治的过程中，人们可以有选择性的选择不同的药剂类型，用量，以节约药剂成本，避免浪费，减少农业污染。因此现有技术迫切需要建立一个快速、准确有效鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的特异性引物组合，本专利技术的另一目的在于提供一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群的方法，特别是对东北种群和华北地区种群进行鉴别。本专利技术中使用的两种线粒体分子标记严格遵守母系遗传，进化速率快，在短时间内即能完成谱系间遗传分化，能够快速实现对黑唇苜蓿盲蝽东北地区和华北地区种群鉴别的目的，是一种非常可靠的分子生物学方法。本专利技术首先提供了用于鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的特异性引物组合，所述特异性引物组合包括两个特异性引物对，分别以黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因和线粒体NADH脱氢酶亚基4基因为靶序列，特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.3-4所示。①Ngri-COI-F：5'–ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATCA–3'(SEQIDNO.1)Ngri-COI-R：5'–CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGAATG–3'(SEQIDNO.2)②Ngri-ND4-F：5'–AAAATACCATTAAAGTAAACAAATCAATTT–3'(SEQIDNO.3)Ngri-ND4-R：5'–ATATATTATTTATTTTTTGAGTGTAGTTTAATCCCT–3'(SEQIDNO.4)本专利技术提供了上述特异性引物组合在制备鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群试剂盒中的用途。所述的种群为东北种群和华北种群。一种含有上述特异性引物组合的鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的试剂盒属于本专利技术的保护范围。本专利技术的试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。进一步地，本专利技术提供一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的方法，包括以下步骤：(1)提取黑唇苜蓿盲蝽基因组DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA样品为模板，利用本专利技术所述的特异性引物组合分别进行PCR扩增反应；所述特异性引物组合中的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.3-4所示；(3)两次PCR产物纯化，测序，串联，分析。本专利技术的方法中，25μL的PCR反应体系为：2×TaqPCRMasterMix反应缓冲液12.5μL，10μM上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，无菌水补足至25μL。本专利技术的方法中，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，退火温度下退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；所述退火温度为当检测引物为SEQIDNO.1-2时，退火温度为49℃，当检测引物为SEQIDNO.3-4时，退火温度为59.5℃。本专利技术的方法中，步骤(3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后，将测序结果按照COI-ND4进行串联拼接，串联序列长度为1763bp，当第144、690、1188、1676、1704bp处碱基依次为A、A、T、T、A时，待测样品为黑唇苜蓿盲蝽东北种群；当第144、690、1188、1676、1704bp处碱基依次为G、G、C、G、T时，待测样品为黑唇苜蓿盲蝽华北种群。在上述5个位点碱基变异同时满足上述限定的基础上，进一步地，当碱基第81位为A，或第687位为T，或第822位为G，或第1127位为G，或第1257位为G，或第1617位为A，则待测样品为黑唇苜蓿盲蝽东北种群；当碱基第81位为G，或第687位为C，或第822位为A，或第1127位为A，或第1257位为A，或第1617位为G，则待测样品为黑唇苜蓿盲蝽华北种群。本专利技术提供了一种分子标记组合在鉴别黑唇苜蓿盲蝽种群中的应用，所述的分子标记组合是利用SEQIDNO.1-2和SEQIDNO3-4分别对待测种群DNA进行PCR扩增，将2个扩增产物串联，测序，以第144、690、1188、1676、1704bp处的5个碱基位点作为分子标记(当第144、690、1188、1676、1704bp处碱基依次为A、A、T、T、A时，待测样品为黑唇苜蓿盲蝽东北种群；当第144、690、1188、1676、1704bp处碱基依次为G、G、C、G、T时，待测样品为黑唇苜蓿盲蝽华北种群)，从而实现对我国黑唇苜蓿盲蝽种群，特别是东北种群华北种群的鉴别。本专利技术提供了特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒在鉴定黑唇苜蓿盲蝽种群中的应用。本专利技术依据黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I(COI)和线粒体NADH脱氢酶亚基4(ND4)两个基因片段分别设计特异性引物，以待鉴别物种基因组DNA为模板，进行PCR，将PCR扩增产物进行串联比对，从而实现对我国黑唇苜蓿盲蝽东北种群和华北种群的鉴定。本专利技术方法简单可靠，灵敏度高、特异性强，耗时短、可操作性强，稳定性好，可重复性强，具有良好的应用前景。附图说明图1-图7分别为本专利技术实施例1中黑唇苜蓿盲蝽东北种群和华北种群的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)和线粒体NADH脱氢酶亚基4(ND4)两个基因片段的串联序列比对结果；其中，“*”表示相同碱基，加黑数字代表变异位点所在位置。图8为本专利技术实施例3中利用引物Ngri-COI-F/Ngri-COI-R进行PCR扩增的结果；其中，泳道1-15为黑唇苜蓿盲蝽样本，16-21为牧草盲蝽，22-24为阴性对照，M为2000bpDNAMarker。图9为本专利技术实施例3中引物Ngri-COI-F/Ngri-COI-R的PCR扩增反应体系灵敏度检测结果；其中，1-6分别代表DNA样品经106、105、104、103、102、101倍稀释结果，7-9为阴性对照，M为2000b本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocoris ngritylus)种群的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包括两个引物对，分别以黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因和线粒体NADH脱氢酶亚基4基因为靶序列，引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2和SEQ ID NO.3‑4所示。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包括两个引物对，分别以黑唇苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因和线粒体NADH脱氢酶亚基4基因为靶序列，引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.3-4所示。2.权利要求1所述的特异性引物组合在制备鉴定黑唇苜蓿盲蝽种群试剂盒中的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的种群为东北种群和华北种群。4.一种鉴定黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性引物组合。5.根据权利要求4所示的试剂盒，其特征在于，还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。6.一种利用分子标记鉴别黑唇苜蓿盲蝽(Adelphocorisngritylus)种群的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取黑唇苜蓿盲蝽基因组DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA样品为模板，利用权利要求1所述的特异性引物组合分别进行PCR扩增反应；(3)两次PCR产物纯化，测序，串联，分析。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，25μL的PCR反应体系为：2×TaqPCRMasterMix反应缓冲液12...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利娟，崔金杰，雒珺瑜，张帅，马妍，王春义，吕丽敏，朱香镇，王丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41