一种细菌微流控集成检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌微流控集成检测的方法，增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。该方法可彻底替代细菌检测过程中的人工操作，节约时间和人力成本，能够实现细菌样本的自动化检测。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌微流控集成检测的方法
本专利技术涉及一种细菌微流控集成检测的方法，用于细菌检测的领域。
技术介绍
细菌性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病，仅细菌性食源性致病菌每年约导致美国360万人患病，3.6万人住院，861人死亡。中国每年细菌性食源性疾病发病人数约9411.7万人次，其中2475.3万患者就诊，335.7万患者因病住院，8530例患者死亡。致病菌的检测是细菌性疾病预防控制和相关研究的基石，主要检测对象为临床样本和非临床样本(环境、食品和媒介生物体等样本)。分离培养技术是早期出现的致病菌检测技术，以分离和鉴定两个基本步骤为基础，增加增菌步骤，有利于恢复受损菌体和低载量目标菌，同时可抑制竞争性杂菌生长，从而提高检测敏感性。分离培养技术作为标准方法已被广泛应用于各层级实验室，但其增菌、分离及鉴定的前处理步骤大多需要人工操作，程序较复杂，即使目前有自动化的接种仪器和飞行质谱鉴定设备以及上述两种设备的联用系统等可代替部分人力，但总体上因分离培养技术自身程序的复杂性和昂贵的自动化设备普及性受限，分离培养技术仍需占用大量人力，耗时较长。为了克服上述不足，在增菌方面，本申请人首次创新性研制了毛细管色谱式增菌法，利用半固体凝胶的分子吸附原理将选择性增菌剂固定于毛细管中作为固定相，以此预制毛细管为“色谱柱”，以样本增菌液混合液为进样源，利用带鞭毛目标菌自身的动力，在毛细管中由进样端向远端高效地将目标菌从混合菌群中色谱式增菌，且同时可实现预增菌与增菌两步合并进行，可节约大量的人力和时间，已获相关授权专利5项。在分离鉴定方面，致病菌分离培养技术的部分步骤可以被分子生物学检测技术替代，以便于节约人力、加快检测速度。增菌步骤无法由两种技术替代，因两种技术的灵敏性仍有一定局限性(检出限较高)，分子生物学检测技术对不同菌属(种)的检出限为101-103CFU/mL。分子生物学检测技术的核心部分是聚合酶链式反应(PCR)技术，主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR和以及其他基于PCR的技术。目前已有DuPont公司的系列产品、Bio-Rad公司的iQ-系列产品和ThermoFisherScientific公司的SureTectTM系列产品和Cepheid公司的Gene系列产品等实现了一定程度的自动化。但是上述产品均未包括增菌过程，仍需要进行一定的人工辅助操作。综上所述，对于致病菌检测，毛细管色谱式增菌法一定程度简化了增菌的过程，但仍需配以后续繁杂的分离鉴定步骤。PCR技术在节约人力和降低检测成本方面表现出一定优势，但是仍需要辅以增菌过程，需几步人工辅助。目前细菌的检测仍然过程较为复杂，时间和人力成本占用较多。
技术实现思路
为了彻底替代细菌检测过程中的人工操作，节约时间和人力成本，本专利技术旨在提供一种细菌微流控集成检测的方法，能够实现细菌样本的自动化检测。本专利技术的技术方案如下所述：一种细菌微流控集成检测的方法，包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端；所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂填装入细管中；将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。为了更好地应用该方法，在该方法中使用自动细菌微流控集成检测装置，该装置包括：微型管道集成系统、微流控系统和控制系统；其中，所述微型管道集成系统包括取菌针环、增菌细管、DNA提取管和PCR反应管；沿增菌细管长度方向上且在增菌细管的上部设置第一连接管，在增菌细管的下部、与第一连接管相对的位置处设置第二连接管，所述第二连接管通过DNA提取管与PCR反应管相连接；所述取菌针环位于第一连接管内且位于增菌细管上方；所述微流控系统包括传动装置和注射泵；所述控制系统用于控制传动装置以驱动取菌针环穿过增菌细管取菌液后达到DNA提取管，所述控制系统还用于控制注射泵以将DNA提取管中的设定量的液体转移到PCR反应管中。优选的，所述第一连接管的顶端采用密封膜密封。优选的，第一连接管与增菌细管的接触部位采用密封膜密封(或隔开)，使第一连接管与增菌细管成为两个独立的封闭空间。优选的，所述增菌细管与第二连接管的接触部位采用密封膜密封(或隔开)，使增菌细管与第二连接管成为两个相对独立的封闭空间；当然，为了使得结构更加简单，该密封膜结构可省略。优选的，第二连接管与DNA提取管的连接处采用密封膜密封，使第二连接管与DNA提取管成为两个独立的封闭空间。优选的，所述取菌针环是由柄基、接种环和针状部件依次相连构成的。进一步优选的，所述针状部件为针。进一步优选的，所述取菌针环的柄基顶端与传动装置相连。优选的，所述增菌细管，包括细管以及用于装填细管中的含有选择性增菌剂和营养物质的半固体凝胶；或者，所述增菌细管，包括细管以及用于装填细管中的吸附有选择性性增菌剂的大分子吸附材料、营养液。优选的，所述第一连接管、增菌细管和第二连接管的集成为一体形成，或者，各个部分是可拆卸的。进一步优选的，当各个部分是可拆卸时，第一连接管和第二连接管通过四通接头与增菌细管相连接，其中接头将增菌细管分成两段细管。优选的，所述第二连接管上设有气压平衡孔，以微孔滤膜封孔。优选的，所述DNA提取管，包括细管、用于装填细管中的DNA提取液和用于密封细管两端的密封膜；或者，所述DNA提取管，是由两根细管连接而成，其中一根细管装填溶菌酶，另一根细管中装填DNA提取液。优选的，所述PCR反应管，包括细管、用于装填细管中的PCR反应试剂；或者，进一步包括装填细管中的荧光检测相关试剂。优选的，所述PCR反应管末端内部设有微孔滤芯。优选的，所述PCR反应管通过二通阀与注射泵相连。优选的，所述DNA提取管与PCR反应管之间设有三通阀。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有如下有益效果：本专利技术可以代替原有细菌检测过程中仍需要人工增菌的繁杂的操作过程，将增菌过程、DNA提取过程和PCR反应过程进行集成一体化，可节约时间和人力成本，此外自动化操作可降低人工操作中的失误几率，进一步提高检测的准确性。结合PCR反应的快速检测能力，能够为临床诊断或细菌传染源的快速锁定提供快速的技术支持，有利于及早地循证诊疗，提高治疗的有效性；或者及早地发现传染源，避免疫情的进一步扩大，降低更多的高危人群的感染风险。附图说明图1和图2是本专利技术自动细菌微流控集成检测的装置的结构示意图。图3是接通状态下的三通阀的剖视侧视图。图4是未接通状态下的三通阀的剖视侧视图。图5是三通阀的俯视图。图6是接通状态下的二通阀的剖视侧视图。图7是未接通状态下的二通阀的剖视侧视图。图8是二通阀的俯视图。其中，1、取菌针环，1-1、柄基，1-2、接种环，1-3、针，2、增菌细管，3、DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌微流控集成检测的方法，其特征是，包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端；所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂填装入细管中；将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。

【技术特征摘要】
1.一种细菌微流控集成检测的方法，其特征是，包括以下步骤：增菌过程管道化、DNA提取过程管道化和PCR反应过程管道化；所述增菌过程管道化包括以下步骤：配制增菌基质，然后将增菌基质填装入细管中；所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端；所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂填装入细管中；将增菌过程管道化中的细管一端插入样本增菌液中进行增菌；增菌结束后，采用传动装置驱动取菌针环，将增菌过程管道化的细管中的菌液转移至DNA提取过程管道化的细管中；所述菌液在DNA提取过程管道化中的细管中进行DNA提取；提取结束后，采用注射泵将DNA提取过程管道化的细管中的提取液转移至PCR反应过程管道化的细管中进行PCR反应；PCR反应结束后，荧光实时检测或通过电泳检测目标产物。2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述增菌基质为含有选择性增菌剂和营养物质的半固体凝胶，或者是，所述增菌基质为大孔吸附材料和含有选择性增菌剂的培养基。3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述DNA提取过程管道化包括以下步骤：将溶菌酶和DNA提取液填装入细管中，然后用密封膜密封细管两端。4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述PCR反应过程管道化包括以下步骤：将PCR反应试剂和荧光检测试剂填装入细管中。5.如权利要求1所述的方法，其特征是：还包括使用增菌培养控温系统实现原位增菌培养。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘岚铮，刘辉，曹若明，胡光春，时玉雯，刘铭，李健，
申请(专利权)人：济南市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：山东,37