口含烟制品细菌回复突变的检测方法技术

本发明专利技术提供一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，经过样品前处理方法、增菌培养、受试菌浓度确定、平板掺入、结果判定等步骤。本发明专利技术综合考察口含烟制品的暴露途径，作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的细菌回复突变试验检测方法。

【技术实现步骤摘要】
口含烟制品细菌回复突变的检测方法
本专利技术涉及一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价

技术介绍
现今，化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重视。B．N．Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）被世界各国及组织广为采用，是目前国际公认的检测新药、食品添加剂,食品包装材料及化妆品等的致突变性、致癌性的首选试验[1-3]。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用细菌回复突变试验(Ames试验)对卷烟烟气冷凝物潜在的致突变性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟制品和不含烟叶原料的新型口含烟制品（如烟草含片）。口含烟制品的使用方式与传统卷烟吸入式不同，口含烟制品直接经口使用，且其溶出物会随唾液进入消化系统，使用过程中不产生烟气，其暴露途径显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测剂量也有所不同，用于检测传统卷烟致突变性的细菌回复突变试验(Ames试验)不能满足口含烟制品致突变性检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定口含烟制品细菌回复突变试验的标准方法，因此，有必要针对口含制品自身特点建立适合口含烟制品的细菌回复突变试验检测方法，确保产品的安全性。上文涉及的参考文献：[1]中华人民共和国卫生部.GB15193-2003食品安全性毒理学评价程序[S]。[2]中国食品药品监督管理局.YY/T0127.10-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)[S]。[3]中华人民共和国卫生部.GB7919-87化妆品安全性评价程序和方法[S]。
技术实现思路
本专利技术的目的是为衡量口含烟制品的安全性，提供一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，在传统卷烟制品细菌回复突变实验方法的基础上改进得到的一种适合于口含烟制品致突变性检测的细菌回复突变试验方法。本专利技术通过下列技术方案实现：一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，经过下列各步骤：（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL人工唾液，于37℃下恒温水浴锅中静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；（2）增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，加入无菌小三角瓶中，将主平板或冷冻保存的TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡培养10h或静置培养16h，得菌液；（3）受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤（2）的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至其OD值为0.3，得到检测用菌液；（4）受试样品组剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：6.25μg/皿、12.5μg/皿、25μg/皿、50μg/皿；（5）阳性对照、自发回变组和溶剂对照的设定：阳性组：选择2-氨基芴作为TA98的阳性物，剂量为2μg/皿；选择叠氮钠作为TA100的阳性物，剂量为1μg/皿；自发回变组：加入步骤（3）的检测用菌液0.1mL；溶剂对照组：加入人工唾液，剂量为5μL/皿；（6）S9混合液的配制：制备浓度为10%（V/V）的S9混合液备用；（7）平板掺入：将步骤（3）的检测用菌液0.1mL和步骤（6）所得浓度为10%（V/V）的S9混合液0.5mL混合，分别加入步骤（4）中四种浓度的步骤（1）所得待测液0.1mL，再加入2.0mL37℃保温的顶层培养基，再在涡轮混合器上混匀后迅速倒入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化，置于37℃恒温培养箱中培养48h，作为受试样品检测组；步骤（5）中的阳性组、未处理组、溶剂对照组均按本步骤操作；（8）结果判定：观察步骤（7）的培养基，分别计数阳性对照、自发回变组、溶剂对照和受试样品组培养基上长出的回复突变菌落数，如在背景生长良好的条件下（阳性对照组、自发回变组回复突变菌落数在GB15193.4附录A规定范围内，且溶剂对照组诱发的回复突变菌落数等于或小于自发回变组回复突变菌落数的2倍且无剂量效应关系时），受试样品组诱发的回变菌落数等于或大于自发回变组回复突变菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即可认为该受试物诱变试验为阳性，反之为阴性。所述步骤（1）的人工唾液为市购产品。所述步骤（1）的待测液用2mL冻存管分装后放置于液氮中储存。所述步骤（2）中振荡的速率是100次/min。所述步骤（6）的S9混合液是按照GB15193.4-2003食品安全性毒理学评价程序和方法中鼠伤寒沙门氏菌试验标准进行配制。本专利技术的优点在于：综合考察口含烟制品的暴露途径，作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的细菌回复突变试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定，使得本方法能够准确有效的检测口含烟制品的致突变性。具体实施方式下面将结合具体实例对本专利技术做详细描述，但并不限制本专利技术。实施例1用于骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品致突变性的检测。（1）样品前处理方法：准确称取1.0g骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品，加入30mL市购人工唾液，于37℃下恒温水浴锅中静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液，用2mL冻存管分装后放置于液氮中储存；（2）增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，加入无菌小三角瓶中，将主平板或冷冻保存的TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡速率100次/min进行振荡培养10h或静置培养16h，得菌液；（3）受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤（2）的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至其OD值为0.3，得到检测用菌液；（4）受试样品组剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：6.25μg/皿、12.5μg/皿、25μg/皿、50μg/皿；（5）阳性对照、自发回变组和溶剂对照的设定：阳性组：选择2-氨基芴作为TA98的阳性物，剂量为2μg/皿；选择叠氮钠作为TA100的阳性物，剂量为1μg/皿；自发回变组：加入步骤（3）的检测用菌液0.1mL；溶剂对照组：加入人工唾液，剂量为5μL/皿；（6）S9混合液的配制：制备浓度为10%（V/V）的S9混合液备用，S9混合液是按照GB15193.4-2003食品安全性毒理学评价程序和方法中鼠伤寒沙门氏菌试验标准进行配制；（7）平板掺入：将步骤（3）的检测用菌液0.1mL和步骤（6）所得浓度为10%（V/V）的S9混合液0.5mL混合，分别加入步骤（4）中四种浓度的步骤（1）所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL人工唾液，于37℃下静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；（2）增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，加入无菌小三角瓶中，将主平板或冷冻保存的TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡培养10h或静置培养16h，得菌液；（3）受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤（2）的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至其OD值为0.3，得到检测用菌液；（4）受试样品组剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：6.25μg/皿、12.5μg/皿、25μg/皿、50μg/皿；（5）阳性对照、自发回变组和溶剂对照的设定：阳性组：选择2‑氨基芴作为TA98的阳性物，剂量为2μg/皿；选择叠氮钠作为TA100的阳性物，剂量为1μg/皿；自发回变组：加入步骤（3）的检测用菌液0.1mL；溶剂对照组：加入人工唾液，剂量为5μL/皿；（6）S9混合液的配制：制备浓度为10%（V/V）的S9混合液备用；（7）平板掺入：将步骤（3）的检测用菌液0.1mL和步骤（6）所得浓度为10%（V/V）的S9混合液0.5 mL混合，分别加入步骤（4）中四种浓度的步骤（1）所得待测液 0.1 mL，再加入2.0mL 37℃保温的顶层培养基，再混匀后迅速倒入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化，置于37℃恒温培养箱中培养48h，作为受试样品检测组；步骤（5）中的阳性组、未处理组、溶剂对照组均按本步骤操作；（8）结果判定：观察步骤（7）的培养基，分别计数阳性对照、自发回变组、溶剂对照和受试样品组培养基上长出的回复突变菌落数，受试样品组诱发的回变菌落数等于或大于自发回变组回复突变菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即可认为该受试物诱变试验为阳性，反之为阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL人工唾液，于37℃下静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；（2）增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，加入无菌小三角瓶中，将主平板或冷冻保存的TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡培养10h或静置培养16h，得菌液；（3）受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤（2）的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至其OD值为0.3，得到检测用菌液；（4）受试样品组剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：6.25μg/皿、12.5μg/皿、25μg/皿、50μg/皿；（5）阳性对照、自发回变组和溶剂对照的设定：阳性组：选择2-氨基芴作为TA98的阳性物，剂量为2μg/皿；选择叠氮钠作为TA100的阳性物，剂量为1μg/皿；自发回变组：加入步骤（3）的检测用菌液0.1mL；溶剂对照组：加入人工唾液，剂量为5μL/皿；（6）S9混合液的配制：按照GB15193.4-2003食品安全...

【专利技术属性】
技术研发人员：夭建华，管莹，曾婉俐，米其利，朱洲海，高茜，唐萍，李雪梅，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53