本发明专利技术公开了一种新型造血干细胞检测试剂制备方法和应用。所述制备方法，包括：溶解甲基纤维素，依次按照比例加入IMDM培养基、胎牛血清、经过离子交换树脂处理的牛血清白蛋白、2-ME、重组人干细胞生长因子、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素3。本发明专利技术获得的造血干细胞检测试剂可以检测人和小鼠骨髓、外周血、脐带血中的造血干细胞数量，富有应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型的造血干细胞检测试剂制备方法和应用，具体的说是涉及人和鼠的造血干细胞检测试剂的制备方法。技术背景:造血干细胞具有自我更新和定向分化的两大功能。造血干细胞在体内定向分化为粒系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、巨核祖细胞，粒系祖细胞又进一步分化为粒细胞、单核细胞、巨噬细胞，发挥免疫和抗细菌感染作用；淋巴系祖细胞分化为淋巴细胞，发挥免疫和抗病毒感染作用；红系祖细胞分化为红细胞，发挥输送氧气，排出二氧化碳的功能，巨核祖细胞分化为血小板，发挥抗凝血功能，从而实现造血。在人体中，造血干细胞存在于骨髓，当造血干细胞发生病理性数量减少时，粒系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、巨核祖细胞就会减少，血液中白细胞、红细胞、血小板也会减少，人体就会患再生障碍性贫血。造血干细胞移植是治疗白血病、再生障碍性贫血等疾病的有效方法。造血干细胞移植需要对造血干细胞数量进行检测，以确保人体获得足够数量的造血干细胞，保证移植获得成功。在体外，只要提供合适的造血干细胞生长条件，即造血干细胞培养基，造血干细胞可以分化成粒单系造血细胞集落和红系造血细胞集落，粒单系造血细胞集落中含有造血干细胞分化的粒系造血祖细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞；红系造血细胞集落中含有红系造血祖细胞、红细胞。根据集落数量，测定造血干细胞的数量。
技术实现思路
:本专利技术的目的在于提供一种造血干细胞活性检测的方法。一种新型的造血干细胞培养基试剂，是由下述步骤组成:1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37°C。2.于步骤(I)中加入頂01(2父)2501^，并反复振荡200次，使之充分混匀后置41:冰箱中，2小时后，置_20°C冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4°C冰箱中保存。3.称取BSAlOOg，加入去离子水440mL，混匀，4°C过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50筛孔离子交换树脂15g，4 °C下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4°C下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后100rpm / min,离心30分钟，测体积，再加等体积2X IMDM混勻，无菌过滤，分装1mL /管，_20°C冻存备用。4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10% BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重组人干细胞生长因子，10uL重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子，10uL重组人白细胞介素3，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.lmL，充分混匀，-20°C冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4°C保存备用。至此，一种新型的造血干细胞检测试剂制备已经完成。上述全部过程均在无菌环境中进行操作。实施例11.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37°C。2.于步骤(I)中加入頂01(2父)2501^，并反复振荡200次，使之充分混匀后置41:冰箱中，2小时后，置_20°C冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4°C冰箱中保存。3.称取BSAlOOg，加入去离子水440mL，混匀，4°C过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50筛孔离子交换树脂15g，4 °C下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4°C下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后100rpm / min,离心30分钟，测体积，再加等体积2X IMDM混勻，无菌过滤，分装1mL /管，-20°C冻存备用。4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10% BSA1.5mL, 100uL2_ME，10uL重组人干细胞生长因子，10uL重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子，10uL重组人白细胞介素3，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.lmL，充分混匀，-20°C冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4°C保存备用。制备的造血干细胞检测试剂检测人(或鼠)骨髓造血干细胞:1.骨髓造血干细胞制备:取淋巴细胞分离液(比重1.077) 3mL，于离心管中，取骨髓液3mL，加入3mLPBS，充分混匀，将充分混匀的骨髓液轻轻的加入淋巴细胞分离液表面，2000rpmX20min,离心，骨髓细胞分层，上层为血浆，下层为红细胞，中间层白膜层富含造血干细胞，取中间白膜层放置于1mLPBS中，离心100rpmX 1min,洗涤2次，骨髓造血干细胞沉淀于试管底部，去除上清液，加入20%胎牛血清，调整细胞数至IXlO6 / mL，备用。2.取10uL骨髓造血干细胞(IXlO5细胞)悬液于试管中，加入甲基纤维素，充分混匀后，将含有骨髓造血干细胞的甲基纤维素放置于细胞培养皿中，置于37°C，5 %的C02培养箱中湿度培养7天，倒置显微镜下，观察结果。3.集落计数:采用OLympus CKX41倒置式显微镜，目镜10X，分别采用物镜4X、1X和20X观察，采用物镜4X集落计数。CFU-GM:细胞数量大于40个的细胞团为集落。其形态分3种，a.致密型:细胞紧密成团，细胞个体较小，是以粒细胞为主。b.混合型:细胞团中央为聚集的粒细胞，周围弥散分布单核细胞或巨噬细胞。C.疏散型:细胞团比较均匀分散，细胞个体较大，多由单核巨噬细胞组成。CFU-E、BFU-E:呈粉红色/暗红色/橙色，CFU-E含1_2个细胞族，有8-200个细胞，BFU-E为2个以上细胞族，至少含200个细胞。CFU-GEMM:至少含50个细胞，多为粒细胞和巨噬细胞，巨核细胞和有核红细胞数量不定。正常情况下，I X 15骨髓造血干细胞中含有CFU-GM大约70-80个集落，含有CFU-E和BFU-E集落60-70个，含有CFU-GEMM集落5_7个。实施例21.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15-30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37°C。2.于步骤(I)中加入RPMI1640(2X)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4°C冰箱中，2小时后,置-20°C冰箱冻结,24小时后取出，于室温中融化,分装,置4°C冰箱中保存。3.称取BSAlOOg，加入去离子水440mL，混匀，4°C过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501 (D) 20-50筛孔离子交换树脂15g，4 °C下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4°C下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后100rpm / min,离心30分钟,当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型的造血干细胞检测试剂，其特征在于，是由下述步骤组成：1.称取甲基纤维素11克，加入煮沸的250mL去离子水中，用加热磁力搅拌器不断的搅拌，使之充分混匀，继续煮沸15‑30分钟后，将瓶取下，于室温中冷却至37℃。2.于步骤(1)中加入IMDM(2×)250mL，并反复振荡200次，使之充分混匀后置4℃冰箱中，2小时后，置‑20℃冰箱冻结，24小时后取出，于室温中融化，分装，置4℃冰箱中保存。3.称取BSA100g，加入去离子水440mL，混匀，4℃过夜，次日补充去离子水至500mL，加入AG501(D)20‑50筛孔离子交换树脂15g，4℃下轻轻搅拌直到树脂完全变色，再加离子交换树脂15g，4℃下搅拌过夜。如果部分树脂保留蓝色，表BSA完全去离子，倘若不见蓝色树脂，需再加离子交换树脂15g，继续搅拌过夜，过滤去除离子交换树脂，然后1000rpm／min，离心30分钟，测体积，再加等体积2×IMDM混匀，无菌过滤，分装10mL／管，‑20℃冻存备用。4.在离心管中依次加入胎牛血清3mL，10％BSA1.5mL，100uL2‑ME，100uL重组人干细胞生长因子，100uL重组人粒‑巨噬细胞集落刺激因子，100uL重组人白细胞介素3，最后加入步骤(2)配置的甲基纤维素5.1mL，充分混匀，‑20℃冻存，次日取出，于室温中融化，分装，4℃保存备用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春艳，
申请(专利权)人：上海吉泉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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