本发明专利技术公开了一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法。该方法具体包括如下步骤：1）将蛹虫草菌丝体反复冻融后进行水浴超声，以超声后滤液作为待测样品；2）将步骤1）获得的待测样品，以及腺苷和/或虫草素标准品的溶液，分别进行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所述待测样品中的腺苷和/或虫草素的含量。该方法，与现有方法相比不需要对液体发酵培养的湿菌丝进行干燥处理，可同时测定菌丝体中腺苷和虫草素含量，测得腺苷的线性范围为2-50μg/mL，虫草素的线性范围为3-50μg/mL，腺苷和虫草素的检出限分别为1.1μg/mL、2.4μg/mL，两种成分的回收率分别为94%-100%、99%-103%。该方法具有省时、节能、分析速度快等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法，特别涉及一种利用高效液相色谱同时测定超声处理过的蛹虫草湿菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法。
技术介绍
蛹虫草（Cordyceps militaries）又名北虫草，在我国分布广泛，蛹虫草作为药食两用真菌已被选入食品新资源目录。近年来，人们已经从蛹虫草子实体及菌丝中分离得到多种生物活性物质，主要有腺苷、虫草素、虫草多糖、D-甘露醇、SOD酶、甾醇类等成分，具有抗炎、抗氧化，抗肿瘤、抗癌、提高免疫力等多种生理功能。研究显示蛹虫草中的腺苷、虫草素等有效成分的含量与野生冬虫夏草相当，具有广阔的应用前景。 目前，蛹虫草人工培育技术已较为成熟，根据培养方式的不同可分为固体栽培和液体发酵两种，与固体栽培相比，液体发酵具有周期短、工艺简单、不易污染、菌丝体产量大等优点。作为蛹虫草质量评价的重要指标，腺苷和虫草素成为蛹虫草菌丝体发酵培养的重要指示性物质，因此，快速、有效的检测方法对于指导蛹虫草液体发酵工艺研究具有重要的意义。 目前，腺苷和虫草素含量是利用高效液相色谱、毛细管电泳等方法来检测的，而蛹虫草湿菌丝中腺苷和虫草素含量的测定普遍是采用检测干菌丝中两种成分含量来实现的，在湿菌丝干燥过程存在耗时长、耗能多、成分易于变化等缺点。如牛双等人对蛹虫草菌丝体中腺苷测定（NIU Shuang,GAO Xiang,AN Jin-shuang,GUO Jing-jing,TENG Li-rong,LU Jia-hui.Optimization of the Water Extraction Technique of Cordyceps militaris Mycelium Adenosine via Response Surface Methodology[J].Li Shizhen Medicine and Medical Research.2009,20(2):323-324.）中采用真空冷冻干燥作为样品前处理，只测定了腺苷一种组分，不能同时检测腺苷、虫草素，且此方法耗时耗能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法。 本专利技术所提供的检测蛹虫草菌丝体中腺苷和/或虫草素的含量的方法，具体可包括如下步骤： （1）将蛹虫草菌丝体反复冻融后进行水浴超声，以超声后滤液作为待测样品； （2）将步骤（1）获得的待测样品，以及腺苷和/或虫草素标准品的溶液，在相同条件下分别进行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所述待测样品中的腺苷和/ 或虫草素的含量。 在所述方法的步骤（1）中，所述反复冻融的次数可为1-3次（如2-3次）；1次所述冻融为：液氮中冷冻20-30min，转至50-60℃解冻10-15min。进一步，对于虫草素，所述反复冻融的次数以2-3次更佳。 在所述方法的步骤（1）中，所述水浴超声的条件为35-45KHz（如40KHz）持续超声，温度可为30-50℃（如40-50℃），时间可为2-4h。进一步，对于腺苷，所述温度以40-50℃更佳。 在所述方法的步骤（2）中，所述高效液相色谱的条件如下：色谱柱可为C18色谱柱；流动相为甲醇和水按照体积比为(10-20):(80-90)（如15:85）的比例混合而成的溶液；洗脱方式为单一流动相洗脱，洗脱时间为15min。 在本专利技术中，所述色谱柱为Klomasail C18（150mm×4.6mm5μm particle size）色谱柱。更加具体的，为瑞典AKZO NOBEL公司产品，其产品目录号为EH04713。 进一步，步骤（2）中，所述高效液相色谱的流速可为1mL/min，进样量可为20μL，柱温可为25℃。 在所述方法的步骤（1）中，所述蛹虫草菌丝体具体是按照如下方法获得：将蛹虫草发酵液1600-1800g（如1700g）离心15-20min，弃上清，获得所述蛹虫草菌丝体。 所述蛹虫草发酵液是将所述蛹虫草菌丝体的种子液（菌体浓度为1g/100mL，菌丝质量/菌液体积）接种于发酵培养基，培养后获得的。所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蔗糖70g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母浸提物30g/L、豆饼粉15g/L、K2HPO4·3H2O2g/L、MgSO4·7H2O1g/L；pH为7。所述培养为25℃200r/min振荡培养7天。所述接种的比例为：所述蛹虫草菌丝体的种子液为所述发酵培养基的体积的5%。 所述蛹虫草菌丝体的种子液是按照如下方法获得的：将蛹虫草的菌种接种于种子培养基，培养后获得的。所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、K2HPO4·3H2O0.5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L；pH为7。所述培养为25℃200r/min振荡培养3天。 在所述方法的步骤（1）中，在将所述蛹虫草菌丝体进行所述反复冻融后，所述水浴超声前，还包括向所述蛹虫草菌丝体中加水的步骤，加水量为每8-10mL所述蛹虫草发酵液中获得的所述蛹虫草菌丝体中加水40mL。 在所述方法的步骤（2）中，所述超声后滤液按照如下方法获得：将超声后液体离心（如1700g离心20min）后取上清用0.45μm过滤膜过滤，所得滤液即为所述超声后滤液。 在所述方法的步骤（2）中，所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液为腺苷和/或虫草 素标准品的水溶液。 进一步，所述腺苷和/或虫草素标准品具体可为如下任一种： （1）腺苷标准品；（所述方法为检测蛹虫草菌丝体中腺苷的含量的方法时） （2）虫草素标准品；（所述方法为检测蛹虫草菌丝体中虫草素的含量的方法时） （3）腺苷标准品和虫草素标准品的混合物；（所述方法为同时检测蛹虫草菌丝体中腺苷和虫草素的含量的方法时） 更加具体的，在本专利技术中，所述腺苷标准品为Sigma公司产品，其产品目录号为A925；所述虫草素标准品为Sigma公司产品，其产品目录号为C33941。 在所述方法的步骤（2）中，所述“将步骤（1）获得的待测样品，以及腺苷和/或虫草素标准品的溶液，在相同条件下分别进行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所述待测样品中的腺苷和/或虫草素的含量”，具体可为： A1）将系列浓度的所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液按照如上所述条件进行高效液相色谱检测，以所述腺苷标准品的浓度为横坐标，以所述腺苷标准品的峰面积为纵坐标，绘制腺苷标准曲线；将步骤（1）获得的待测样品按照如上所述条件进行高效液相色谱检测，将与所述腺苷标准品相同保留时间的色谱峰的峰面积带入所述腺苷标准曲线，得到所述待测样品中的腺苷的含量；和/或 A2）将系列浓度的所述腺苷和/或虫草素标准品的溶液按照如上所述条件进行高效液相色谱检测，以所述虫草素标准品的浓度为横坐标，以所述虫草素标准品的峰面积为纵坐标，绘制虫草素标准曲线；将步骤（1）获得的待测样品按照如上所述条件进行高效液本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和/或虫草素的含量的方法，包括如下步骤：（1）将蛹虫草菌丝体反复冻融后进行水浴超声，以超声后滤液作为待测样品；（2）将步骤（1）获得的待测样品，以及腺苷和/或虫草素标准品的溶液，分别进行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所述待测样品中的腺苷和/或虫草素的含量。
【技术特征摘要】
1.一种检测蛹虫草菌丝体中腺苷和/或虫草素的含量的方法，包括如下步骤：
（1）将蛹虫草菌丝体反复冻融后进行水浴超声，以超声后滤液作为待测样品；
（2）将步骤（1）获得的待测样品，以及腺苷和/或虫草素标准品的溶液，分别进
行高效液相色谱检测，根据检测结果计算得到所述待测样品中的腺苷和/或虫草素的含
量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述反复冻融的次
数为1-3次；1次所述冻融为：液氮中冷冻20-30min，转至50-60℃解冻10-15min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述水浴超声
的条件为35-45KHz持续超声。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述超声的温度为30-...
【专利技术属性】
技术研发人员：王增利，毕研丽，陈晓侠，宋渊，陈阳，张纪柏，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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