一种快速检测ALK基因断裂的探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种使用荧光原位杂交技术快速检测ALK基因断裂的方法，其特征在于每个靶位点的检测需要三种探针，分别为：接触探针、扩增探针和荧光探针。其中接触探针的5’端特异性地与ALK基因断裂位点两端结合，3’端有20组20碱基的重复序列，可以特异性地与扩增探针相结合；扩增探针的5’端特异性地与接触探针的3’端结合，3’端有20组20碱基的重复序列，可以特异性地与荧光探针结合；荧光探针的5’末端带有CY3或FITC标记，通过这三种探针的协同作用，将荧光信号放大400倍，实现ALK基因断裂快速、灵敏的检测。本发明专利技术还公开了一种快速检测ALK基因断裂的试剂盒及探针组。

Probe set, reagent kit and method for fast detecting ALK gene breakage

The invention discloses a method for rapid detection of ALK gene disruption using fluorescence in situ hybridization, which is characterized in that the detection of each target site requires three probe, respectively: contact probe, probe amplification and fluorescence probe. The contact probe 5 'end specifically with ALK gene breakpoint ends with 3' end repeat 20 groups of 20 base pairs, can specifically combine with the amplified probe; probe amplification of 5 'and 3' end specifically with contact probe combination, repeat 3 'end the 20 group of 20 bases, can specifically combine with fluorescent probe; fluorescent probe of the 5' end with CY3 or FITC markers, the synergy between the three probes, the fluorescence signal amplification 400 times, detection of ALK gene breaking fast and sensitive. The invention also discloses a reagent kit and a probe group for rapidly detecting the breaking of ALK gene.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测ALK基因断裂的探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种探针组和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，快速检测样品中的ALK基因断裂。
技术介绍
肺癌是中国乃至全球致死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer，NSCLC)是最常见的亚型，约占肺癌发病率的85％。近年来，随着对NSCLC分子生物学特征的深入研究，晚期NSCLC已逐渐进入到靶向驱动基因指导的个体化治疗时代。特别是针对ALK基因断裂阳性的NSCLC分子亚型。间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)基因断裂阳性是NSCLC的一个特定分子亚型，约占NSCLC的5％左右。ALK是一种受体酪氨酸激酶，为胰岛素受体(IR)超家族成员。ALK主要表达于发育中的中枢和外周神经系统，在成人中的正常肺等组织中不表达，说明ALK对神经系统的正常发育和功能发挥了作用。虽然ALK的正常生理功能尚未完全阐明，但是当其与其它基因发生融合重排表达，则具有高度的致癌性。克唑替尼等药物可以对ALK断裂引发的NSCLC进行特异性的靶向治疗。由于上述原因，ALK基因断裂被列入NSCLC临床必检项目，目前临床上检测ALK基因断裂的常见方法有免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)，其中FISH是检测ALK基因断裂的金标准。但传统FISH使用的是基因组探针，探针总长度达100Kb以上，由于探针长度极长，覆盖范围极大，使得部分序列不可避免地出现非特异性杂交，导致背景偏高；同时，过长的探针也经常导致荧光信号点发散，不利于信号的确认和统计。由于传统FISH探针单位长度的荧光强度有限，用减少探针长度的方法来解决上述问题，会使得荧光信号强度降低，不利于检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种探针组，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中ALK基因断裂的方法。本专利技术的快速检测ALK基因断裂的方法与传统FISH方法相比，具有背景低，信号点集中，特异性强，速度快等优点，能快速、高效地检测ALK基因断裂。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速检测ALK基因断裂的探针组，所述探针组由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成，所述接触探针包括接触探针1和接触探针2，所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2，所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2，其中，接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为：接触探针1：5’-TAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCA(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)-3’；扩增探针1：5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)-3’；荧光探针1：5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’；接触探针2：5’-AGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)-3’；扩增探针2：5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)-3’；荧光探针2：5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’。优选地，所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。优选地，所述荧光基团为CY3、FITC或FAM。进一步地，所述接触探针1、所述扩增探针1和所述荧光探针1用于检测ALK基因断裂位点N端，所述荧光探针1将ALK基因断裂位点N端标记为红色荧光，所述接触探针2、所述扩增探针2和所述荧光探针2用于检测ALK基因断裂位点C端，所述荧光探针2将ALK基因断裂位点N端标记为绿色荧光，所述接触探针、所述扩增探针和所述荧光探针的碱基序列中的F表示甲基化的C，J表示甲基化的G，引入F/J两种天然基因组DNA中不存在的碱基，可以有效地减少非特异性杂交，提高检测的特异性。本专利技术还提供了一种用于快速检测ALK基因断裂的试剂盒，所述试剂盒包括杂交液和上述由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成的探针组。进一步地，所述杂交液包括：1～10％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mMNaCl，10～40％(v/v)去离子甲酰胺，5mMNa2EDTA，0.01～1％(v/v)TritonX-100，5～200mMTris-HCl(pH7.5)，0.1～1％的吐温80，0.1～1％的三甲铵乙内酯。本专利技术最后提供了一种上述试剂盒快速检测ALK基因断裂的方法，包括如下步骤：(1)吸取10μL样本滴在载玻片上，在56℃下烘干，使样本固定在载玻片上；(2)在室温下将载玻片浸入二甲苯中脱蜡2次，每次10min，随后在100％乙醇中浸泡5min，接着依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min复水，在90℃下浸入纯化水中煮20-30min，每5min将载玻片取出观察一次，防止样本脱落，取出载玻片，在室温下将其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脱水，自然晾干；(3)分别吸取0.5μL的接触探针1、接触探针2、扩增探针1、扩增探针2、荧光探针1和荧光探针2，加入到17μL杂交缓冲液中，混匀，离心，得到探针混合物；(4)将20μL探针混合物滴于载玻片的杂交区域，盖片，胶水封边，置于杂交仪中杂交30min；(5)去除载玻片上的封片胶和盖玻片，在67±1℃下干燥2h，然后将其浸入含0.3％(v/v)NP-40的0.4×SSC溶液中漂洗2min，其间晃动1～2次，在暗处自然晾干；(6)将10μLDAPI复染剂滴于载玻片的杂交区域，加盖盖玻片，静置10min，用荧光显微镜镜检。本专利技术的技术要点或原理：荧光原位杂交(FlourescenceinsituHybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法；传统的荧光原位杂交由于单条探针的荧光强度有限，只能通过用多条探针共同作用的方法来提高荧光信号强度，这些探针单条长度约200～500bp，覆盖总计高达100Kb以上的基因组区域。由于探针数量多，覆盖范围广，不可避免的有部分探针会产生非特异性杂交，从而导致背景上升。同时，由于探针的覆盖范围过大，很多时候荧光信号不能精确地聚成一个点，而是会发散开来，影响检测和结果判读，此外，传统FISH检测需经历长达16小时的杂交，检测时间长，检测效率低。本专利技术通过引入接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针，并通过这三种探针与靶基因(ALK)的相互作用，将荧光信号放大400倍，且杂交时间仅需要30分钟；本专利技术通过在三种探针中引入F(甲基化的C)和J(甲基化的G)两种天然DNA中不存在的碱基，来提高三种探针相互作用的精度，有效地避免非特异性杂交。本专利技术通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为42-58℃，甲酰胺最佳浓度为10-40％，分子信标的最佳浓度为10ng/L。本专利技术荧光探针5’端的荧光基团，包括但不限于Cy3、FITC或FAM等，可以根据现有技术进行添加。与传统荧光原位杂交方法相比，本专利技术提供的方法具有以下优点：1、本专利技术的探针组特异性地识别AL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测ALK基因断裂的探针组，其特征在于，由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成，所述接触探针包括接触探针1和接触探针2，所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2，所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2，其中，接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为：接触探针1：5’‑TAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCA(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)‑3’；扩增探针1：5’‑CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)‑3’；荧光探针1：5’‑CY3‑JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA‑3’；接触探针2：5’‑AGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)‑3’；扩增探针2：5’‑FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)‑3’；荧光探针2：5’‑FITC‑AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测ALK基因断裂的探针组，其特征在于，由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成，所述接触探针包括接触探针1和接触探针2，所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2，所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2，其中，接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为：接触探针1：5’-TAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCA(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)-3’；扩增探针1：5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)-3’；荧光探针1：5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’；接触探针2：5’-AGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)-3’；扩增探针2：5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)-3’；荧光探针2：5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’。2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述荧光基团为CY3或FITC。4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述接触探针1、所述扩增探针1和所述荧光探针1用于检测ALK基因断裂位点N端，所述荧光探针1将ALK基因断裂位点N端标记为红色荧光，所述接触探针2、所述扩增探针2和所述荧光探针2用于检测ALK基因断裂位点C端，所述荧光探针2将ALK基因断裂位点N端标记为绿色荧光。5.根据权利要求4所述的探针组，其特征在于，所述接触探针、所述扩增探针和所述荧光探针的碱基序列中的F和J为两种天然基因组DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：方国伟，洪冉，
申请(专利权)人：苏州达麦迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32