一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒及其引物对和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒及其引物对和探针。所述试剂盒包括至少一种反应液，所述反应液包括一引物对和一探针，所述的引物对和探针针对结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的下游趋化因子CXCL9、CXCL11或CXCL13的基因序列设计。本试剂盒优选采用实时荧光定量PCR法，操作简便、耗时短、特异性强、灵敏度高且可定量，避免原有的结核检测方法受外界因素干扰导致假阳性而结果不准确，同时能够准确、灵敏地检测各期、特别是潜伏期的结核感染。

Kit for detecting latent tuberculosis infection and primer pair and probe thereof

The invention discloses a kit for detecting latent tuberculosis infection, and a primer pair and a probe thereof. The kit comprises at least a reaction liquid, the reaction solution including a primer and a primer on the probe, and probe for the secretion of specific T cells of Mycobacterium tuberculosis more downstream gene sequence design factor CXCL9, CXCL11 or CXCL13. The kit is optimized by using real-time fluorescence quantitative PCR method, simple operation, short time, high specificity, high sensitivity and quantitative detection of tuberculosis, avoid the original method of interference caused by external factors and false positive results are not accurate, and can accurately and sensitively detect the period, especially the latent tuberculosis infection.

【技术实现步骤摘要】
一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒及其引物对和探针
本专利技术涉及一种结核感染的试剂盒，尤其涉及采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术来检测包含潜伏期在内的全程结核感染的试剂盒及其引物对和探针。
技术介绍
从全球范围来看，结核至今为止仍然是传染病中发病率和死亡率最高的疾病之一，据估计每年新发病例约900，0000人，每年约有200，0000人死于结核病。结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病，是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。我国是结核病高负担国家之一，2000年全国结核病流行病学抽样调查资料显示：全年龄组结核感染率为44.5％，活动性结核患者451万，每年死亡人数达13万，结核病死亡占各种传染病，寄生虫病死亡的65.1％，几乎为其它各种传染病、寄生虫病死亡总和的2倍。由于人类免疫缺陷病毒的广泛传播及耐药结核分枝杆菌的日益增多，使得这一古老的疾病再次引起人们的广泛关注。结核病成为危害人类健康的重要传染病之一。由于诊断潜伏性结核感染的检测方法研究进展缓慢，导致结核疫情控制不佳。目前，全血γ-干扰素释放试验(IGRA)已经在欧美地区和日本等多个低结核疫情国家广泛使用，IGRA采用起源于卡介苗接种菌及大多数非结核分枝杆菌所缺失的结核菌致病菌中的RD1-区所编码的特异性刺激蛋白如ESAT-6和CFP-10来进行检测，该类刺激物已经有商品化IGRA试剂，例如QuantiFERONTBGoldtest和TSPOT.TBtest。有研究者在IGRA检测中量化干扰素-γ(IFN-γ)mRNA表达水平，将其作为IFN-γ指示物，但IFN-γRT-PCR的特异性和灵敏度较差，且无法鉴别活跃期和潜伏期结核感染(LTBI)。在中国，TST作为一种基于对结核菌衍生的纯化蛋白(PPD)所产生的迟发型变态反应的检测方法仍然是用来诊断结核菌潜伏性感染(LTBI)的主要方法。TST的敏感度和特异度都依赖于一个特定群体中所定义的不同截断值而定。如果提高反应硬结直径截断值特异度就会增加(同时敏感度下降)。该实验的特异度变化很大而且主要依赖与非结核分支杆菌之间的交叉反应的可能性而定。另外，TST不能区分陈旧感染与新近感染，与卡介苗及环境非结核分支杆菌之间存在交叉免疫而导致假阳性，更由于在免疫抑制人群中检测结果存在假阴性甚至可能导致误诊。重复TST反应或者两步法TST检测可能导致助推效应从而引起敏感度的增加。TST和IGRAs均不能鉴别潜伏期和活动期结核，而根除结核的关键之一在于鉴别潜伏性结核感染。因此，探索一种特异性强、灵敏度高的诊断潜伏性结核感染的检测方法至关重要。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是近年在普通PCR基础上发展起来的核酸检测方法，它将荧光值的积累与PCR产物的扩增过程相结合，通过测量指数扩增期的荧光值来计算待测样本中核酸的原始量。其具有操作简便、耗时短、可定量等传统方法无可比拟的优点。另外，趋化因子是一类结构功能相似，具有趋化吸引性的小分子量蛋白，其一级结构十分相似，当趋化因子与其相应受体相结合后，通过激活G蛋白偶联受体，产生级联信号传导，对多种炎性细胞趋化和激活，在呼吸系统、心血管和肝肾等疾病中起重要作用。比如，由活化的淋巴细胞分泌的下游趋化因子γ-干扰素在结核感染检测中敏感度达80％。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的针对结核感染的检测方法不能鉴别潜伏性结核感染以及现有检测方法特异性或敏感度不强等缺陷，提供一种检测包含潜伏期在内的全病程结核感染的试剂盒、特别是荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂盒及其引物对和探针。该试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、耗时短以及可定量等优点，特别能够检测潜伏期和/或早期的结核感染。本专利技术人首先选择结核感染、特别是潜伏结核感染时，活化的T细胞被激活时，特异的靶分子会发生上调，意外发现趋化因子CXCL9、CXCL11和CXCL13中的一种或两种以上的组合均对于潜伏结核感染有较好的灵敏度和特异性。然后进一步针对上述趋化因子挑选合适的检测方法。由于与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，FQ-PCR方法可以在扩增反应进行的过程中随时监测扩增产物的产生，从而极大的提高了定量检测的准确性和精密度，故本专利技术优选FQ-PCR方法。实时荧光定量PCR(Taqman探针法)在PCR的扩增中，同时加入了引物和在5’末端和3’末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，探针序列保持完整，荧光发生基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故没有荧光信号的产生，而当探针与靶序列能够互补结合时，在PCR扩增进行的过程中，DNA聚合酶在引导DNA序列复制的同时其5’-3’端外切酶活性将切断荧光探针，导致荧光发生基团与荧光淬灭基团的分离，从而荧光检测系统可以接收并记录荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光信号的产生，荧光信号的积累与PCR产物的形成完全同步，故可以实时地监测整个PCR反应过程，并可借助标准曲线或表达量恒定的内对照产物对未知的靶多核苷酸进行绝对或相对的定量分析。因此，探针和引物的设计对于实现靶多核苷酸的定量检测至关重要。本专利技术人为此反复试验和研究，在特异性和敏感度等方面进行平衡，筛选出了测定趋化因子CXCL9、CXCL11和CXCL13的相关引物对和探针。本专利技术解决上述技术问题的技术方案之一是：一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒，其包括至少一种反应液，所述反应液包括目的基因的一引物对和一探针，所述的引物对和探针针对结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的下游趋化因子CXCL9、CXCL11或CXCL13的基因序列设计；其中，针对趋化因子CXCL9设计的所述引物对的正向引物(引物1)是如SEQIDNO.1所示序列的核酸，反向引物(引物2)是如SEQIDNO.2所示序列的核酸，所述探针(探针1)的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；针对趋化因子CXCL11设计的所述引物对的正向引物(引物3)是如SEQIDNO.3所示序列的核酸，反向引物(引物4)是如SEQIDNO.4所示序列的核酸，所述探针(探针2)的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；或者针对趋化因子CXCL13设计的所述引物对的正向引物(引物5)是如SEQIDNO.5所示序列的核酸，反向引物(引物6)是如SEQIDNO.6所示序列的核酸，所述探针(探针3)的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。其中，引物1位于人的CXCL9基因序列的197-221位，引物2位于289-265位，扩增片段长度为93bp，所对应的探针位于234-260位；引物3位于人的CXCL11基因序列的113-136位，引物4位于255-230位，扩增片段长度为143bp，所对应的探针位于184-211位；引物5位于人的CXCL13基因序列的199-224位，引物6位于314-293位，扩增片段长度为116bp，所对应的探针位于226-249位。较佳地，使结果可靠，抗干扰能力更强，作为表达量参照，本专利技术选用管家基因作为内部参照，优选人β-globin(β-球蛋白)基因，所述的反应液均还包括针对人β-globin基因设计的管家基因的一引物对和一探针；所述引物对中，正向引物(引物7)是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒，其特征在于，其包括至少一种反应液，所述反应液包括一引物对和一探针，所述的引物对和探针针对结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的下游趋化因子CXCL9、CXCL11或CXCL13的基因序列设计；其中，针对趋化因子CXCL9设计的所述引物对的正向引物是如SEQ ID NO.1所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.2所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；针对趋化因子CXCL11设计的所述引物对的正向引物是如SEQ ID NO.3所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.4所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或者针对趋化因子CXCL13设计的所述引物对的正向引物是如SEQ ID NO.5所示序列的核酸，反向引物是如SEQ ID NO.6所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测包含潜伏期结核感染的试剂盒，其特征在于，其包括至少一种反应液，所述反应液包括一引物对和一探针，所述的引物对和探针针对结核分枝杆菌特异性T细胞分泌的下游趋化因子CXCL9、CXCL11或CXCL13的基因序列设计；其中，针对趋化因子CXCL9设计的所述引物对的正向引物是如SEQIDNO.1所示序列的核酸，反向引物是如SEQIDNO.2所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；针对趋化因子CXCL11设计的所述引物对的正向引物是如SEQIDNO.3所示序列的核酸，反向引物是如SEQIDNO.4所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；或者针对趋化因子CXCL13设计的所述引物对的正向引物是如SEQIDNO.5所示序列的核酸，反向引物是如SEQIDNO.6所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液均还包括一管家基因的引物对和一探针；所述引物对中，正向引物是如SEQIDNO.7所示序列的核酸，反向引物是如SEQIDNO.8所示序列的核酸，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液均还包括PCR反应缓冲液和2’-脱氧核苷三磷酸；较佳地，所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度为100mM。4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒；和/或所述试剂盒还包括EZTaq混合液和阴性质控品；所述EZTaq混合液包括热启动Taq酶，浓度优选1-5U/μl；更佳地，所述试剂盒还包括结核抗原管和本底对照管，所述结核抗原管中包含抗原刺激物或其组合物；所述抗原刺激物或其组合物优选抗原CFP10衍生肽、抗原ESAT6衍生肽、抗原PPE衍生肽和抗原Ag85A衍生肽中的至少一种；所述抗原CFP10衍生肽的氨基酸序列优选如SEQIDNO.13所示，所述抗原ESAT6衍生肽的氨基酸序列优选如SEQIDNO.14所示，所述抗原PPE衍生肽的氨基酸序列优选如SEQIDNO.15所示，所述抗原Ag85A衍生肽的氨基酸序列优选如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖伟明，
申请(专利权)人：苏州创澜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32