一种高密度、高稳定性的核酸芯片及其制备方法技术

本发明专利技术涉及基因芯片技术领域，公开了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，包括(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在4℃左右反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在4℃左右反应；(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在65℃左右进行反应获得核酸芯片。本发明专利技术还提供了本发明专利技术的方法制备的用于核酸芯片的片基和核酸芯片。

Nucleic acid chip with high density and high stability and preparation method thereof

The present invention relates to the technical field of gene chip, preparation method discloses nucleic acid chip with a high density and high stability, including (1) the silicon substrate in solid solid substrate hydroxylation, get hydroxylated; (2) the solid substrate the hydroxylated amino and first derivative reagent to get coupling. Solid substrate amino; (3) the solid substrate and the chlorine modified reagent amination reaction at 4 DEG C, by coupling substrate in solid active groups of chlorine; (4) the step (3) by solid substrate and second amino derivative reagent at room temperature; (5) the step (4) solid substrate and chlorine modifying reagent to get a reaction at about 4 DEG C; (6) repeat steps (4), (5) one or more times; (7) the amino modified probe and step (6) obtained by the reaction of solid substrate by nucleic acid chip at 65 degrees celsius. The invention also provides a method for the preparation of the base for nucleic acid and nucleic acid chip chip.

【技术实现步骤摘要】
一种高密度、高稳定性的核酸芯片及其制备方法
本专利技术涉及基因芯片
，特别涉及一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法。
技术介绍
基因芯片又称DNA芯片，广泛应用于DNA测序，基因表达和表达差异，基因突变和基因组多态性检测，病原分析，基因诊断和疾病预后分析，病理学、毒理学、药理学、疫苗研究和肿瘤研究等多个方面。基因芯片的制备方法主要有物理吸附、共价键连接、链亲和霉素-生物素三种方法。第一，物理吸附主要是利用DNA探针带负电荷与固相支持表面的正电荷之间的吸引力的作用。物理吸附的优点是不需要对核酸进行修饰，简单、直接、快速等；缺点是连接DNA探针杂乱无章拥挤没有方向性，比较容易解析，不能够重复利用等。第二，共价键连接是利用固相支持物表面进行化学修饰活化，对核酸末端进行化学官能团修饰，通过化学共价键将DNA探针连接到固相基底。共价键连接的优点是连接稳定好，键合力强，可以重复利用等；缺点是需要利用各种化学分子进行键合作用，键合时间长，不可逆转性，局部拥挤效应等。第三，链亲和霉素-生物素是利用链亲和霉素修饰在固相支持物上，将生物素修饰在DNA末端，通过利用链亲和霉素与生物素之间的相互作用使得DNA固定化。链亲和霉素-生物素的优点是有比较好的方向性、特异性和功能性，比较容易控制，可逆转性等；缺点是价格昂贵，芯片生产缓慢，拥挤效应，特定的生物适合的条件要求，不能重复利用等。图1是DNA芯片的制备方法的示意图。目前，商业化基因芯片主要为氨基芯片和醛基芯片，二者都属于共价键连接的芯片。其中醛基芯片适用于DNA富集，但醛基芯片上的化学官能团修饰为可逆反应，DNA探针容易脱落，连接不稳定。图2是商业化DNA芯片醛基芯片的制备示意图。因此，本领域需要改进核酸与固相支持表面的连接。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前现有技术的不足，提供了一种新型的、简单的化学修饰方法，高密度、高稳定地连接目标核酸探针。本专利技术通过对固相基底材料表面进行氨基衍生、活性基团氯修饰，进而连接氨基核酸探针,制备出高密度，高稳定性的核酸芯片。因此，本专利技术提供了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应；(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在60℃至70℃，优选65℃下进行反应获得基因芯片。在一个实施方案中，所述第一和第二氨基衍生试剂选自：多聚赖氨酸、不同类型的氨基硅烷偶联剂、不同分子量的聚乙烯亚胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、乙二胺、己二胺等带有伯氨基、仲氨基化合物中的任意一种。在一个实施方案中，所述第一氨基衍生试剂为氨基硅烷偶联剂。在一个实施方案中，所述第二氨基衍生试剂为聚乙烯亚胺。在一个实施方案中，所述氯修饰试剂为三聚氰氯。在一个实施方案中，在步骤(6)中，重复步骤(4)、(5)1-5次。在一个实施方案中，在步骤(6)中，重复步骤(4)、(5)直至所述固相基底上达到最大活性基团氯数量。在另一方面，本专利技术还涵盖利用本专利技术的方法制备的核酸芯片以及用于核酸芯片的片基。因此，本专利技术还提供了一种核酸芯片，所述核酸芯片包括：表面上连接有活性基团氯的片基和氨基修饰的探针，所述氨基修饰的探针的氨基通过与所述片基表面上的活性基团氯的SN2亲核取代反应固定于所述片基表面。在一个实施方案中，本专利技术还提供了一种用于核酸芯片的片基，所述用于核酸芯片的片基包括：硅基固相基底、第一氨基衍生试剂、第二氨基衍生试剂和氯修饰试剂；所述第一氨基衍生试剂通过-O-与所述硅基固相基底偶联；所述氯修饰试剂通过两种方式连接在所述硅基固相基底表面上：(1)所述氯修饰试剂的第一活性基团氯与连接在固相基底上的第一氨基衍生试剂的氨基发生SN2亲核取代反应；或(2)所述第二氨基衍生试剂的第一氨基与连接在所述硅基固相基底表面上的氯修饰试剂的第二活性基团氯发生SN2亲核取代反应，连接在所述硅基固相基底表面上；所述氯修饰试剂的第一活性基团氯与连接在所述硅基固相基底表面上的第二氨基衍生试剂的第二氨基发生SN2亲核取代反应。在一个实施方案中，所述氯修饰试剂为三聚氰氯。在一个实施方案中，在所述硅基固相基底表面有最大活性基团氯数量。利用本专利技术的方法制备的核酸芯片密度高，稳定性高。附图说明通过以下附图对本专利技术进行说明图1是DNA芯片的制备方法的示意图，从A-C分别示例性给出了物理吸附、共价键连接、链亲和霉素-生物素结合。图2是商业化DNA芯片醛基芯片的制备示意图。图3示出了本专利技术的DNA芯片的制备方法一个示例。A示出玻片上的硅被浓硫酸双氧水羟基化，得到羟基化玻片；B示出将所述羟基化玻片与氨基硅烷偶联剂进行偶联；C示出将所述氨基化玻片与三聚氰氯反应，三聚氰氯通过与聚乙烯亚胺发生SN2亲核取代反应连接至所述氨基化玻片上；D示出将C中得到的玻片与聚乙烯亚胺反应；E示出将D中得到的玻片与三聚氰氯反应，三聚氰氯通过氨基连接至所述氨基化玻片上；F示出将氨基修饰的探针与连接三聚氰氯的玻片进行反应获得核酸芯片。图C-E中，(a)和(b)为同一结构的不同表示。图4示出了利用x射线光电子能谱仪(xps)获得芯片表面活性基团的图谱，通过所述图谱可以确定每步反应的分子结构：A为羟基片表征图谱；B为氨基片表征图谱；C为聚合物玻片表征图谱；D为DNA芯片表征图谱。图5示出了通过qPCR检测目标DNA浓度。具体实施方式本专利技术通过利用化学方法将目标核酸探针固定于固相基底材料上的核酸芯片技术，尤其是利用特定的固相基底材料及特殊的化学修饰把大量目标核酸探针高密度、高稳定地固定于基底材料上本专利技术提供了一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与氨基衍生试剂反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂反应；(6)重复步骤(4)、(5)直至所述固相基底上达到最大活性基团氯数量；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底进行反应获得核酸芯片。优选地，在步骤(3)中，在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下进行反应；在步骤(4)中，在室温下进行反应；在步骤(5)中，在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下进行反应；在步骤(7)中，在60℃至70℃，优选65℃下进行反应。在本专利技术中，步骤(4)中，固相支持物表面的三聚氰氯与氨基衍生试剂发生SN2亲核取代反应，使得氨基衍生试剂能够共价连接于固相支持物表面；在步骤(5)中氯修饰试剂上的氯与连接在固相基底上的氨基发生SN2亲核取代反应，从而使得氯基团固定于固相支持物表面。通过如此循环(步骤6)，放大活性基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在‑2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在‑2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应；(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在60℃至70℃，优选65℃下进行反应获得核酸芯片。

【技术特征摘要】
1.一种高密度、高稳定性的核酸芯片的制备方法，所述方法包括步骤：(1)将硅基固相基底羟基化，得到羟基化的固相基底；(2)将所述羟基化的固相基底与第一氨基衍生试剂进行偶联，得到氨基化的固相基底；(3)将所述氨基化的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应，得到偶联活性基团氯的固相基底；(4)将步骤(3)得到的固相基底与第二氨基衍生试剂在室温下反应；(5)将步骤(4)得到的固相基底与氯修饰试剂在-2℃至6℃，优选0℃至4℃下反应；(6)重复步骤(4)、(5)一次或多次；(7)将氨基修饰的探针与步骤(6)得到的固相基底在60℃至70℃，优选65℃下进行反应获得核酸芯片。2.权利要求1的方法，所述第一和第二氨基衍生试剂选自：多聚赖氨酸、不同类型的氨基硅烷偶联剂、不同分子量的聚乙烯亚胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、乙二胺、己二胺等带有伯氨基、仲氨基化合物中的任意一种；优选地，所述第一氨基衍生试剂为氨基硅烷偶联剂，例如γ-氨丙基三乙氧基硅烷，所述第二氨基衍生试剂为聚乙烯亚胺。3.权利要求1或2的方法，所述氯修饰试剂为三聚氰氯。4.权利要求1-3任一项的方法，在步骤(6)中，重复步骤(4)、(5)1-5次。5.权利要求4的方法，在步骤(6)中，重复步骤(4)、(5)直至所述固相基底上达到最大活性基团氯数量。6.权利要求1-3任一项的方法，所述硅基固相基底为玻璃、陶瓷、硅或石英。7.一种用于核酸芯片的片基，所述用于核...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵柏闻，李晓霖，沈广强，
申请(专利权)人：北京量化健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11