一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，包括检测包括APOE、SLCO1B1、CETP、ABCB1、MTHFR基因位点的引物对和探针对。本发明专利技术应用MGB(minor groove binder)探针与实时荧光PCR技术，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99.5％以上等优点；主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀等。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒
本专利技术属于他汀类药物检测领域，特别涉及一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒。
技术介绍
他汀类药物是使用广泛的降脂药，能有效地防治心脑血管疾病，在美国超过25％的年纪大于45岁的人服用他汀类药物。尤其在冠心病经皮支架植入术(PCI)后二级预防中，采用积极的他汀调脂治疗对冠心病防治有重要意义。他汀类药物随着剂量的升高，降低LDL的作用增强，但同时不良反应发生率也高。他汀类一个主要的毒副反应是肌病，有5～29％的患者会发生他汀引起的肌病(statininducedmyopathy，SIM)，主要表现为疲乏、无力、肌痛、肌肉痉挛、有的出现严重危害生命的横纹肌溶解(rhabdomyolysis)，引起患者死亡。肌病影响用药依从性，33％出现肌病的患者会自行停药，引起死亡、再次心梗等心血管事件的发生，对患者的生存构成严重的威胁。根据基因诊断进行个体化用药可保障用药安全、节省医药开支，并已逐渐成为临床治疗的新趋势。尤其是检测下列5种代表性基因具有重要的用药指导意义：(1)ApoE属载脂蛋白家族，主要在肝脏和脑组织中表达，通过多种途径参与机体的脂质代谢，是影响血脂水平的重要内在因素。ApoE基因定位于人类19号染色体上，主要有两种单核苷酸多态性，形成3种单倍型，分别为ApoE2(388T-526T)、ApoE3(388T-526C)和ApoE4(388C-526C)。ApoE基因多态性被认为是高脂蛋白血症及动脉粥样硬化性血管病的易感候选基因。人群中有6种不同的ApoE表型：三种纯合子(E2/2、E3/3、E4/4)和三种杂合子(E3/2、E4/2、E4/3)。其中，ApoE3/3是野生型(Wild-type)。ApoE2携带者的他汀类药物降脂效果好，ApoE4携带者他汀类药物的降脂效果较差。(2)SLCO1B1基因具有很高的遗传多态性。突变型SLCO1B1基因引起编码的转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险。SLCO1B1*1a、*1b、*15是常见的基因突变类型，其中*1b、*15是他汀类药物主要不良反应“横纹肌溶解症”的独立决定因子。该突变基因携带者相比未突变者发生肌毒性的风险增加约20倍。服用他汀类药物前对该突变进行检测对发生肌毒性的预测和预防具有重要意义。(3)CETP胆固醇酯转移蛋白，基因组第一内含子Taq1B第277位点的SNP(G/A)多态性对他汀类药物的反应效果有明显的影响。其中B1B1基因型和B1B2基因型个体他汀类药物调脂效果好，而B2B2基因型个体对他汀类药物治疗反应较弱。(4)ABCB1多耐药基因1，表达蛋白为药物转运体，基因序列中有两个位点SNP多态性对他汀类药物代谢有一定的影响，分别为基因组2677位点和3435位点，这两个位点都为突变型个体使用阿托伐他汀时的降脂效果小。(5)MTHFR高血压患者，TT基因型，用普伐他汀治疗，出现致死性冠心病和非致死性心肌梗塞的风险，比CC基因型高。CC基因型是保护性的基因型，风险低。CT基因型，介于二者之间。目前，国内有针对他汀类药物代谢基因APOE和SLCO1B1基因多态性检测的相关试剂盒，但针对5种基因(APOE、SLCO1B1、CETP、ABCBI、MTHFR)的检测试剂盒目前还没有任何厂家推出。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，该试剂盒应用MGB探针与实时荧光PCR技术，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99.5％以上等优点；主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀等。本专利技术的一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测APOE、SLCO1B1、CETP、ABCBI、MTHFR位点的引物对和探针对，具体序列如下：所述试剂盒还包括DNA聚合酶、UNG酶、dNTPs、镁离子和PCR缓冲液。所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。所述试剂盒引物对的浓度为400nM；探针对的浓度为300nM。所述试剂盒用于定量PCR的反应体系为：总体积25μl，20μlPCRMIX和5μlDNA模板。所述试剂盒用于定量PCR的反应条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃45s，40个循环。有益效果本专利技术应用MGB探针与实时荧光PCR技术，具有省时方便、灵敏度高、样品阳性符合率及阴性符合率均99.5％以上等优点；主要用于他汀类药物的个性化用药辅助诊断：辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀等。附图说明图1为实施例1SLCO1B1基因rs2306283位点检测阳性对照品结果图；图2为实施例1SLCO1B1基因rs2306283位点检测阴性对照品结果图；图3为实施例1SLCO1B1基因rs2306283位点检测待测样本结果图；图4为实施例1SLCO1B1基因rs4149056位点检测阳性对照品结果图；图5为实施例1SLCO1B1基因rs4149056位点检测阴性对照品结果图；图6为实施例1SLCO1B1基因rs4149056位点检测待测样本结果图；图7为实施例1APOE基因rs429358位点检测阳性对照品结果图；图8为实施例1APOE基因rs429358位点检测阴性对照品结果图；图9为实施例1APOE基因rs429358位点检测待测样本结果图；图10为实施例1APOE基因rs7412位点检测阳性对照品结果图；图11为实施例1APOE基因rs7412位点检测阴性对照品结果图；图12为实施例1APOE基因rs7412位点检测待测样本结果图；图13为实施例1CETP基因Taq1B位点检测阳性对照品结果图；图14为实施例1CETP基因Taq1B位点检测阴性对照品结果图；图15为实施例1CETP基因Taq1B位点检测待测样本结果图；图16为实施例1ABCB1基因rs1128503位点检测阳性对照品结果图；图17为实施例1ABCB1基因rs1128503位点检测阴性对照品结果图；图18为实施例1ABCB1基因rs1128503位点检测待测样本结果图；图19为实施例1ABCB1基因rs1045642位点检测阳性对照品结果图；图20为实施例1ABCB1基因rs1045642位点检测阴性对照品结果图；图21为实施例1ABCB1基因rs1045642位点检测待测样本结果图；图22为实施例1MTHFR基因rs1801131位点检测阳性对照品结果图；图23为实施例1MTHFR基因rs1801131位点检测阴性对照品结果图；图24为实施例1MTHFR基因rs1801131位点检测待测样本结果图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术所述检测方法及流程，而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11、核酸DNA提取1.1在1.5ml离心管中依次加入200ul待测全血样本、20ul蛋白酶K、400ul裂解液，漩涡震荡混匀后于56℃水浴或金属浴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测包括APOE、SLCO1B1、CETP、ABCB1、MTHFR基因位点的引物对和探针对，具体序列如下：SLCO1B1 rs2306283位点：Q201‑F1：TTCTTACAGTTACAGGTATTCT；Q201‑R1：TATCTCAGGTGATGCTCTA；Q201‑WP1：AACTAATATCAATTCATCAGAA；Q201‑MP1：AACTAATATCGATTCATCAGAA；SLCO1B1 rs4149056位点：Q202‑F1：ATAGGTTGTTTAAAGGAATCTG；Q202‑R1：TTAGCGAAATCATCAATGTAAG；Q202‑WP1：TGGATATATGTGTTCATGGG；Q202‑MP1：TGGATATATGCGTTCATGGG；APOE rs429358位点：Q301‑F1：TGTCCAAGGAGCTGCAG；Q301‑R1：AGCTCCTCGGTGCTCT；Q301‑WP1：AGGACGTGTGCGGC；Q301‑MP1：AGGACGTGCGCGGC；APOE rs7412位点：Q302‑F1：CAAGCTGCGTAAGCGG；Q302‑R1：GCGGATGGCGCTGAG；Q302‑WP1：TGCAGAAGCGCCTG；Q302‑MP1：TGCAGAAGTGCCTG；CETP Taq1B位点：Q401‑F1：TAGGGATTTGTGTTTGTCTGCGA；Q401‑R1：TGACTTTGGCCATAGAGTGAC；Q401‑WP1：TTCGAGTTAGGGTTCAGA；Q401‑MP1：TTCAAGTTAGGGTTCAGA；ABCB1 rs1128503位点：Q501‑F1：TCTGTGAATTGCCTTGAAGTT；Q501‑R1：ATCAGCTGGACTGTTGTGCT；Q501‑WP1：TTGAAGGGTCTGAACCT；Q501‑MP1：TTGAAGGGCCTGAACCT；ABCB1 rs1045642位点：Q502‑F1：TTGCCTATGGAGACAACAGCCG；Q502‑R1：TTGAAGAGAGACTTACATTAGG；Q502‑WP1：AAGAGATCGTGAGGGCAG；Q502‑MP1：AAGAGATTGTGAGGGCAG；MTHFR rs1801131位点：Q601‑F1：TTCTACCTGAAGAGCAAGTC；Q601‑R1：TTTGTGACCATTCCGGTTT；Q601‑WP1：CCAGTGAAGAAAGTGTCTT；Q601‑MP1：CCAGTGAAGCAAGTGTCTT。...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测他汀类药物代谢基因多位点突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测包括APOE、SLCO1B1、CETP、ABCB1、MTHFR基因位点的引物对和探针对，具体序列如下：SLCO1B1rs2306283位点：Q201-F1：TTCTTACAGTTACAGGTATTCT；Q201-R1：TATCTCAGGTGATGCTCTA；Q201-WP1：AACTAATATCAATTCATCAGAA；Q201-MP1：AACTAATATCGATTCATCAGAA；SLCO1B1rs4149056位点：Q202-F1：ATAGGTTGTTTAAAGGAATCTG；Q202-R1：TTAGCGAAATCATCAATGTAAG；Q202-WP1：TGGATATATGTGTTCATGGG；Q202-MP1：TGGATATATGCGTTCATGGG；APOErs429358位点：Q301-F1：TGTCCAAGGAGCTGCAG；Q301-R1：AGCTCCTCGGTGCTCT；Q301-WP1：AGGACGTGTGCGGC；Q301-MP1：AGGACGTGCGCGGC；APOErs7412位点：Q302-F1：CAAGCTGCGTAAGCGG；Q302-R1：GCGGATGGCGCTGAG；Q302-WP1：TGCAGAAGCGCCTG；Q302-MP1：TGCAGAAGTGCCTG；CETPTaq1B位点：Q401-F1：TAGGGATTTGTGTTTGTCTGCGA；Q401-R1：TGACTTTGGCCATAGAGTGAC；Q401-WP1：TTCGAGTTAGGGTTCAGA；Q401-MP1：TTCAAGTTAGGGTTCAGA；ABCB1rs1128503位点：Q501-F1：TCTGTGAATTGCCTTGAAGTT；Q501-R1：ATCAGCTGGACTGTTGTGCT；Q501-WP1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓晶，沈挺，李春燕，宋毅，
申请(专利权)人：宁波美晶医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33