基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，所述试剂盒中包括：（1）核酸释放剂；（2）内标；（3）PCR反应液；（4）酶混合液；（5）LRBA阳性对照；（6）LRBA阴性对照。本发明专利技术试剂盒是检测抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的有效工具，使用本发明专利技术试剂盒，可检测LRBA基因突变情况，实现对抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的检测，填补市场空白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测抗CTLA-4抗体药物疗效的试剂盒，尤其涉及一种基于LRBA 基因检测抗CTLA-4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的试剂盒。
技术介绍
黑色素瘤是临床上较为常见的皮肤黏膜和色素膜肿瘤，恶性程度极高，黑色素瘤 晚期患者的中位生存期为7~9个月，1年内的生存率仅为25%。在过去30年，黑色素瘤 发病率明显增加，死亡率也在持续性上升。据世界卫生组织（WHO)统计，每年死于皮肤癌的 患者大约有66000人，其中80%死于黑色素瘤。 细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA- 4)又名⑶152,是由CTLA- 4基因编码的一 种跨膜蛋白质，表达于活化的CD4+和CD8+T细胞。CTLA-4与其配体B7分子结合后产生抑 制性信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA-4的免疫效 应，可刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导或增强抗肿瘤疫反应。基于前述理论，CTLA-4为 许多疾病包括肿瘤的免疫治疗提供了新的方法。因此，发展抗CTLA- 4抗体用于肿瘤的免 疫治疗，是目前肿瘤革G向免疫治疗的热点。Ipilimumab正是祀向作用于CTLA- 4的全人源 化单克隆抗体，其通过作用于APC与T细胞的活化途径而间接活化抗肿瘤免疫反应，达到清 除癌细胞的目的。目前，该抗体药物已用于黑色毒瘤的治疗中，但市场上尚未有检测该抗体 药物疗效的检测产品。目前，已有美国NIH过敏及传染性疾病研究所的研究人员发现，T细胞中的^^-responsive beige - like anchor (LRBA)基因能通过溶酶体抑制CTLA4, CTLA4会抑制T细 胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此LRBA的基因突变可间接刺激免疫细胞大量 增殖，从而增强抗肿瘤免疫反应。 对于有LRBA突变的患者来说，抗CTLA- 4抗体药物治疗更有效。由此可见，抗 CTLA-4抗体药物的疗效与LRBA发生基因突变有关，具体可参见《PatientswithLRBA deficiencyshowCTLA4lossandimmunedysregulationresponsivetoabatacept therapy》一文。但目前尚无检测抗CTLA-4抗体药物疗效的有效工具。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药物疗 效的试剂盒，使用这种试剂盒，检测LRBA基因突变情况，可以预测该抗CTLA-4抗体药物治 疗黑色毒瘤的疗效。 本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，基于LRBA基因检测抗CTLA-4抗体药 物疗效的试剂盒，所述试剂盒中包括： (1)核酸释放剂：为一种无菌水溶液，由60~100mmol/L的氯化钾、0· 01~2wt% (优选〇· 1 - 〇· 5wt% )的十二烷基磺酸钠和0· 05~lwt% (优选0· 1 - 0· 2wt% )的乙 醇组成； 所述百分比以无菌水的质量为计算基准； ⑵内标，序列为： 5 '-CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACC CTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG- 3'。 (3)PCR反应液，包括以下三组由用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用 于靶多核苷酸检测的探针组成的组合物，所述三组组合物分别为：组合物 1:上游引物 11 :5' -TGGCCTCAAGCAGTTCTCCCACTTTG- 3' 下游引物 12 :5' -TACCCCCTTTACCAGTCATTGTCTTC- 3' 探针 13 :5' -TGGATTCTAATCCTCAAGATATCCACCC- 3'组合物 2 :上游引物 21 :5' -TACATAGGGTTTGACTTTATTATTT- 3' 下游引物 22 :5 ' -GTCTCAGCCTGCAGAGTAGCTGGG- 3 ' 探针 23 :5' -TAGAGACAGGGTTTCCCCATGTT- 3'组合物 3 :上游引物 31 :5' -ATTACAGGTGCCTGCCACCATGCCT- 3' 下游引物 32 :5' -CCTTTCACCTATCGCACGAGTATCAT- 3' 探针 33 :5' -TTTTTGTTTTGCTCTTGTCATTACTGGAG- 3'。 其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对75160T，组合物3针对7604OT。 所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针，其序列分 别为：内标上游引物：5 ' -GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG- 3 '内标下游引物：5 ' -CTGATGACATATTTGAGATTGCACC- 3 '内标探针：5' -TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA- 3'。 所述PCR反应液中还包括脱氧核糖核苷三磷酸dNTP;所述脱氧核糖核苷三磷酸 dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP或DTTP。 (4)酶混合液：包括耐热DNA聚合酶（Taq酶）1~5U/μ1和尿嘧啶DNA糖基化酶 (UNG酶）0. 5~2U/μ1 (优选1~1. 2U/μ1)。其中，UNG酶的功能是降解含有dN的PCR产 物，利用UNG酶和PCR反应液中的dNTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本 检测假阴性。 (5)LRBA阳性对照：为针对3种突变位点所在区域合成质粒的混合物，以及包含内 标目的序列片段的质粒，其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对75160T，组合物3针对 7604OT； 所述阳性质粒序列为：AGAGGTTACCCTGCGCCTAGAACCTGCACGAGAGTGGGGGAGGAGTGAGCCTGTTCGGGGGCCTCTTGG ACCTGCCTTCACCCAGAACCCAGCTTTTTGAGCCCGGGAGAAGCGGGTGGCTAGTAGTGGGGTGCCTTTAGTAACTT ACTTGACCGACAATAACTATTTCCCTCTTGTCCCCTCAAAACCCTAAAACAAAACCTAGCCTATTTAACATATATTT AATCTTCCAATAGGGTTTGGCGTTGTTGTCAGCCTCGGGGAGAGAGATTGGACAAATATTCTCCAAGAGGAGGAGGG CGACGCCAAGGACTTTCCACATCAACTGCTTTGGGGTATCTCCACAAGTTGGAAGAGGGACCCTTTCGTTTTGCATT GCGTGTGTTGTGCTCATTACCAGTGCAGCGACTGCCGTCCCAGGGTGACTCTGAGTTGTCCTTTATCGTGAGCTAGC AATGGCTAGCGAAGACAATCGTGTCCCTTCCCCGCCACCAACAGGTGATGACGGGGGAGGTG；(6)LRBA阴性对照：为以灭菌生理盐水稀释的内标目的序列片段的质粒。 本专利技术试剂盒是检测抗CTLA- 4抗体药物治疗黑色毒瘤疗效的有效工具，使用本 专利技术试剂盒，可检测LRBA基因突变情况，实现对抗CTLA-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于LRBA基因检测抗CTLA‑4抗体药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(1)核酸释放剂：为一种无菌水溶液，由60～100mmol/L的氯化钾、0.01～2wt％的十二烷基磺酸钠和0.05～1wt％的乙醇组成；所述百分比以无菌水的质量为计算基准；(2)内标，序列为：5’‐CTGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG‐3’；(3)PCR反应液，包括以下三组由用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针组成的组合物，所述三组组合物分别为：组合物1:上游引物11：5’‐TGGCCTCAAGCAGTTCTCCCACTTTG‐3’下游引物12：5’‐TACCCCCTTTACCAGTCATTGTCTTC‐3’探针13：5’‐TGGATTCTAATCCTCAAGATATCCACCC‐3’组合物2：上游引物21：5’‐TACATAGGGTTTGACTTTATTATTT‐3’下游引物22：5’‐GTCTCAGCCTGCAGAGTAGCTGGG‐3’探针23：5’‐TAGAGACAGGGTTTCCCCATGTT‐3’组合物3：上游引物31：5’‐ATTACAGGTGCCTGCCACCATGCCT‐3’下游引物32：5’‐CCTTTCACCTATCGCACGAGTATCAT‐3’探针33：5’‐TTTTTGTTTTGCTCTTGTCATTACTGGAG‐3’；其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T；所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针，其序列分别为：内标上游引物：5’‐GACCAGCTCCATCCTAAGGTTCCAG‐3’内标下游引物：5’‐CTGATGACATATTTGAGATTGCACC‐3’内标探针：5’‐TTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCCA–3’；所述PCR反应液中还包括脱氧核糖核苷三磷酸dNTP；(4)酶混合液：包括耐热DNA聚合酶1～5U/μl和尿嘧啶DNA糖基化酶0.5～2U/μl；(5)LRBA阳性对照：为针对3种突变位点所在区域合成质粒的混合物，以及包含内标目的序列片段的质粒，其中组合物1针对6745G>T，组合物2针对7516C>T，组合物3针对7604C>T；所述阳性质粒序列为：AGAGGTTACCCTGCGCCTAGAACCTGCACGAGAGTGGGGGAGGAGTGAGCCTGTTCGGGGGCCTCTTGGACCTGCCTTCACCCAGAACCCAGCTTTTTGAGCCCGGGAGAAGCGGGTGGCTAGTAGTGGGGTGCCTTTAGTAACTTACTTGACCGACAATAACTATTTCCCTCTTGTCCCCTCAAAACCCTAAAACAAAACCTAGCCTATTTAACATATATTTAATCTTCCAATAGGGTTTGGCGTTGTTGTCAGCCTCGGGGAGAGAGATTGGACAAATATTCTCCAAGAGGAGGAGGGCGACGCCAAGGACTTTCCACATCAACTGCTTTGGGGTATCTCCACAAGTTGGAAGAGGGACCCTTTCGTTTTGCATTGCGTGTGTTGTGCTCATTACCAGTGCAGCGACTGCCGTCCCAGGGTGACTCTGAGTTGTCCTTTATCGTGAGCTAGCAATGGCTAGCGAAGACAATCGTGTCCCTTCCCCGCCACCAACAGGTGATGACGGGGGAGGTG；(6)LRBA阴性对照：为以灭菌生理盐水稀释的内标目的序列片段的质粒。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖飞，贺毅憬，刘杨，虞健，彭艳，涂超峰，
申请(专利权)人：湖南宏雅基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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