一种多芳基取代咪唑荧光探针及其制备方法和在特异性检测G-四链体中的应用技术

本发明专利技术公开了一种多芳基取代咪唑荧光探针，所述多芳基取代咪唑荧光探针的结构式如式(I)所示，本发明专利技术同时公开上述探针的制备方法及其在特异性检测G‑四链体中的应用。所述探针制备简单、原料易得，并且结构稳定，可用于特异性检测野生型c‑MYC G‑四链体核酸二级结构，通过荧光分光光度计即可快速检测出溶液中的野生型c‑MYC G‑四链体核酸二级结构，而对于突变的c‑MYC G‑四链体或者其他DNA二级结构则不具有荧光响应。所述特异性检测野生型c‑MYC G‑四链体核酸二级结构的方法操作简便，灵敏性和专一性强，能够克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。

A multi aryl substituted imidazole fluorescent probe and preparation method and application in specific detection of G chain in four

The invention discloses a multi aryl substituted imidazole fluorescent probe, the aryl substituted imidazole structure type fluorescent probe as shown in (I), preparation method of the invention also discloses the probe and its application in specific detection of G chain in four. The probe has the advantages of simple preparation, easy to get raw materials, and stable structure, can be used for specific detection of wild type C MYC G four chain nucleic acid secondary structure of two meter, can quickly detect wild type C in the solution MYC G four chain of two level structure of nucleic acid by fluorescence spectrophotometry as for C, MYC G four chain mutation or other DNA two level structure has no fluorescence response. The method for specific detection of wild type C MYC G four chain nucleic acid of two level structure is simple, sensitivity and specificity, the detection method can overcome the price of other expensive equipment requirement is high, the operation is relatively complex technical shortcomings.

【技术实现步骤摘要】
一种多芳基取代咪唑荧光探针及其制备方法和在特异性检测G-四链体中的应用
本专利技术涉及一种新型荧光探针，更具体地，涉及一种多芳基取代咪唑荧光探针及其制备方法和在特异性检测G-四链体中的应用。
技术介绍
G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-KIT、c-MYC、BCL-2、PDGF、KRAS、VEGF和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行型，反平行型与混合型三种构象。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，c-MYC启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出野生型c-MYCG-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。光致电子转移(PET)经常用于设计荧光增强或淬灭型的荧光探针。如果受体部分有一个和荧光团自身HOMO和LUMO轨道有能量差的轨道，就容易发生光致电子转移过程。光致电子转移过程可以从荧光团激发态的LUMO到空轨道。这主要取决于邻近合并的轨道的特点。无辐射的失活过程就是这样发生的，同时我们会看到荧光的淬灭。基于光致电子转移的荧光探针，探针和目标分析物反应后，不是增加就是移除了在荧光团HOMO和LUMO轨道之间的邻近轨道，这样就分别实现了荧光的淬灭或者增强。目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。但是，在体内外实现单一序列G-四链体(比如c-MYC)的检测暂未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种多芳基取代咪唑荧光探针。本专利技术的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。本专利技术的再一个目的在于提供上述探针在特异性检测G-四链体(野生型c-MYC)中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术提供一种多芳基取代咪唑荧光探针，所述多芳基取代咪唑荧光探针的结构式如式(I)为：式中，n＝1，2，3，4，5；R1为氟，二乙胺，吗啡啉，哌啶或N-甲基哌嗪；R2为氟，二乙胺，吗啡啉，哌啶或N-甲基哌嗪。优选地，所述R1与R2相同，R1为N-甲基哌嗪。本专利技术另外提供所述的多芳基取代咪唑荧光探针的制备方法，包括以下步骤：S1.将直接与炔基取代的苯甲醛发生缩合反应，或，先将与二乙胺，吗啡啉，哌啶或N-甲基哌嗪反应，再与炔基取代的苯甲醛发生缩合反应得到S2.将荧光素用浓硫酸酯化得然后通过取代反应引入二溴烷烃侧链得到化合物叠氮化后制得化合物S3.将S1中与S2中进行点击反应，得到所述多芳基取代咪唑荧光探针。以化合物F2为例，制备方法具体表示如下：具体步骤为：先用4,4'-二氟苯偶酰(1a)与N-甲基哌嗪反应，得到化合物1b，再将1b与炔基取代的苯甲醛发生缩合反应，得到1c；将原料荧光素(2a)用浓硫酸酯化得2b；在这基础上，通过取代反应引入1,4-二溴丁烷侧链得到化合物2c，叠氮化后制得化合物2d；最后将1c与2d进行点击反应，得到最终探针化合物F-2。本专利技术同时提供所述的多芳基取代咪唑荧光探针在检测G-四链体中的应用。优选地，所述多芳基取代咪唑荧光探针用于特异性检测野生型c-MYCG-四链体结构。更优选地，通过如下方法检测野生型c-MYCG-四链体结构：S1.将待测DNA溶于pH值为7.2～7.4的缓冲液，得到溶液A；将所述多芳基取代咪唑探针溶解，再用pH值为7.2～7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；S2.将S1中的溶液A和溶液B混合，得到混合液，所述混合液中待测DNA与多芳基取代咪唑探针的摩尔比为10:1，混合后对混合液进行荧光光谱分析，或者在紫外灯下进行肉眼观察。优选地，S2中判断待测DNA为野生型c-MYCG-四链体结构的方法如下：当在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到荧光增强，则待测DNA为野生型c-MYCG-四链体结构；若混合液的荧光强度与溶液B的荧光强度一样或者只有非常微弱的变化，既可以判断待测DNA不为野生型c-MYCG-四链体结构；当对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强，则待测DNA为野生型c-MYCG-四链体结构。若混合液的荧光发射强度与溶液B相比，没有明显增强，则可以判断待测DNA不为野生型c-MYCG-四链体结构。优选地，当对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强5～20倍，则待测DNA为野生型c-MYCG-四链体结构。优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，所述多芳基取代咪唑用二甲基亚砜溶解。优选地，S2中溶液A和溶液B的混合反应时间为1分钟。申请人实验室前期的工作中合成了一系列的三芳基取代咪唑类的化合物，其对G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将本专利技术提供的荧光素结构通过点击反应融合到三芳基咪唑结构当中，得到了新型的G-四链体探针，该探针特异性识别野生型c-MYCG-四链体。其主要原理是光致电子转移(PET)。本专利技术提供的探针由两部分组成，包括识别受体与荧光团，其主要识别原理是光致电子转移(PET)。PET经常用于设计荧光增强或淬灭型的荧光探针。如果受体部分有一个和荧光团自身HOMO和LUMO轨道有能量差的轨道，就容易发生光致电子转移过程。光致电子转移过程可以从荧光团激发态的LUMO到空轨道。这主要取决于邻近合并的轨道的特点。无辐射的失活过程就是这样发生的，同时我们会看到荧光的淬灭。基于光致电子转移的荧光探针，探针和目标分析物反应后，不是增加就是移除了在荧光团HOMO和LUMO轨道之间的邻近轨道，这样就分别实现了荧光的淬灭或者增强。只有当F-2与野生型c-MYCG-四链体相互作用后，受体的HOMO轨道下降，使得荧光团激发态LUMO轨道上的电子能够回到基态，从而产生荧光。当DNA的二级结构不为野生型c-MYCG-四链体结构时，荧光团激发态LUMO轨道上的电子不能够回到基态，这样则不会产生明显的信号变化。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术提供的探针制备简单，原料易得，并且结构稳定，便于储存。(2)本专利技术提供的探针可以特异性地检测识别野生型c-MYCG-四链体结构，实现了单一序列的区分，用简单的荧光光谱就可以识别出野生型c-MYCG-四链体二级结构，操作快捷简便，成本低廉，并且可以实现实地检测，在细胞中单一检测野生型c-MYCG-四链体中具有潜在的应用价值，为研究c-MYC的转录调控提供有力的手段。附图说明图1为探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多芳基取代咪唑荧光探针，其特征在于，所述多芳基取代咪唑荧光探针的结构式如式(I)为：

【技术特征摘要】
1.一种多芳基取代咪唑荧光探针，其特征在于，所述多芳基取代咪唑荧光探针的结构式如式(I)为：式中，n＝1，2，3，4，5；R1为氟，二乙胺，吗啡啉，哌啶或N-甲基哌嗪；R2为氟，二乙胺，吗啡啉，哌啶或N-甲基哌嗪。2.根据权利要求1所述的多芳基取代咪唑荧光探针，其特征在于，所述R1与R2相同，R1为N-甲基哌嗪。3.一种根据权利要求1所述的多芳基取代咪唑荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将直接与炔基取代的苯甲醛发生缩合反应，或，先将与二乙胺，吗啡啉，哌啶或N-甲基哌嗪反应，再与炔基取代的苯甲醛发生缩合反应得到S2.将荧光素用浓硫酸酯化得然后通过取代反应引入二溴烷烃侧链得到化合物叠氮化后制得化合物S3.将S1中与S2中进行点击反应，得到所述多芳基取代咪唑荧光探针。4.权利要求1或2所述的多芳基取代咪唑荧光探针在检测G-四链体中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述多芳基取代咪唑荧光探针用于特异性检测野生型c-MYCG-四链体结构。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过如下方法检测野生型c-MYCG-四链体结构：S1.将待测DNA溶于pH值为7.2～7...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志纾，谭嘉恒，胡命豪，陈硕斌，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44