一种桥式寡核苷酸在文库目标区域捕获中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改良的序列捕获方法，所述方法包括：1)提取DNA，打断；2)将所述打断的DNA的两端与接头连接，所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6‑8nt的标签序列；3)将所述连接接头的DNA进行Pre‑PCR反应；4)将探针与封闭试剂混合，对所述Pre‑PCR反应进行捕获，所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列，其中所述标签序列处用同样长度的C3间臂封闭；5)杂交捕获后PCR扩增。本发明专利技术的桥式封闭设计策略，分别对插入片段的两端的接头序列设计对应的封闭序列，对于中间部分的标签序列采取用C3间臂进行桥式连接，节约成本和简化文库构建过程中的繁琐性。

Application of a bridge oligonucleotide in Library target area acquisition

The invention discloses an improved sequence capture method, which comprises: 1) extracting DNA, interrupting; 2) connecting two ends of the interrupted DNA to a junction, the distal end of the junction sequence of the interrupted DNA including a tag sequence with a length of 6_8nt; 3) Pre_PCR reaction of the DNA of the junction; 4) connecting the probe with the junction; The blocking reagent consists of a closed sequence complementary to the sequence outside the interrupted DNA, wherein the tag sequence is blocked with the same length of C 3 arm; 5) PCR amplification after hybridization capture. The bridge enclosure design strategy of the invention designs the corresponding enclosure sequence for the connector sequence at both ends of the insertion fragment, and uses C3 arm to bridge the tag sequence of the middle part to save cost and simplify the tedious construction process of the library.

【技术实现步骤摘要】
一种桥式寡核苷酸在文库目标区域捕获中的应用
本专利技术属于生物
，更具体而言，本专利技术公开了一种桥式寡核苷酸在文库目标区域捕获中的应用。
技术介绍
在文库构建过程中，往往会引入一些插入片段以外的序列，而这些序列对上机测序、样本区分和追溯原始DNA分子的来源有着重要的意义。然而在杂交捕获过程中需要将这些插入片段以外的非目标序列进行有效封闭，封闭掉这些序列的意义在于，防止在杂交过程中，探针与这些目标区域外的序列进行非特异性结合。同时也需要对标签序列进行有效封闭，否则不同插入片段的文库会通过与标签序列之间进行退火，引起大量文库片段非特异性结合在一起，这样会带来非特异性捕获的严重后果。目前针对于接头和标签序列的封闭采用的是对通用序列和标签序列同时进行封闭，然而对标签序列上的随机碱基采用的是一一对应的封闭策略，一般标签序列的碱基数目为6-8个，根据每次构建文库的个数，一般选择标签序列的种类为96种，用于标签序列的随机碱基数目一般为4-8个，标签序列的种类为44-48种。这样需要设计一一对应的封闭序列的种类为：3×46-3×410。按照这个数量级来合成封闭序列所需要数额成本，具有极大的不可操作性。并且在建库过程中加入对应96种标签序列的封闭序列，增加了建库过程中实验操作的繁琐性。为了控制成本，也有人提出针对标签序列的封闭采取对相应数目次黄嘌呤来进行封闭的策略，然而次黄嘌呤对封闭的碱基具有一定的偏好性，造成了对有些标签序列封闭效果差，进而影响了捕获率，同时合成次黄嘌呤成本比较昂贵。因此，本领域中需要一种对带有标签序列的接头序列进行有效封闭的新策略。
技术实现思路
为了节约成本和简化文库构建过程中的繁琐性，专利技术人提出了一种桥式封闭设计策略，分别对插入片段两端的接头序列设计对应的封闭序列，对于中间部分的标签序列采取用6-8个C3间臂进行桥式连接。因此，本专利技术提供了一种改良的序列捕获方法，所述方法包括：1)提取DNA，打断DNA片段大小范围为160bp-180bp，优选末端修复和3’端加“A”；2)将所述打断的DNA的两端与接头连接，所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第一标签序列，优选在所述DNA另一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第二标签序列；3)利用所述接头序列的互补序列将所述连接接头的DNA进行Pre-PCR反应，优选通过所述Pre-PCR在所述连接接头的DNA两端引入测序接头序列；4)将探针与封闭试剂混合，对所述Pre-PCR反应产物进行杂交捕获，所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列，其中所述第一标签序列处用同样长度的C3间臂进行封闭，优选与所述第二标签序列处用同样长度的C3间臂封闭；5)杂交捕获后PCR扩增，利用所述接头序列的互补序列。在一个实施方案中，其中在2)中，将所述打断的DNA的两端与两个接头分别连接，成线形DNA分子。在一个实施方案中，其中在2)中，将所述打断的DNA的两端与一个接头的两端分别连接，成环形DNA分子。在一个实施方案中，其中在4)中，所述探针与目标序列互补配对序列长度一般为80-120bp，优选100bp，用于获取目标区域序列。在一个实施方案中，其中在4)中，所述探针包括两翼固定长度序列，其长度一般为10-30bp，优选15bp，用于扩增大量可以用于捕获的探针。在一个实施方案中，其中在2)中，所述接头是：Adapter-1:ACCGAGATCT[标签序列]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.2)，Adapter-2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQIDNO.11)；其中在3)中，将所述带有接头的DNA进行Pre-PCR反应；引物是：PE1.0:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQIDNO.1)；PE2.0:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT；其中在4)中，所述探针序列：TGCCTCTTTATCTGT(SEQIDNO.20)(探针左翼固定序列)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQIDNO.21)(探针右翼固定序列)所述封闭寡核苷酸序列：a-1:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+6-8个C3间臂+GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQIDNO.5)；a-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.10)b-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQIDNO.1)+6-8个C3间臂+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.2)；b-2:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCA+6-8个C3间臂+GTCACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQIDNO.4)；其中在5)中，所述引物是：P5:AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDNO.12)，P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO.13)。在一个实施方案中，其中在2)中，所述接头是：5′-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCUACACTCTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQIDNO.19)；其中在3)中，所述引物是：标签序列引物：5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.10)-3′；UniversalPCR引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′(SEQIDNO.18)；其中在4)中，所述探针序列：TGCCTCTTTATCTGT(SEQIDNO.20)(探针左翼固定序列)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQIDNO.21)(探针右翼固定序列)所述封闭寡核苷酸序列：a-1:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQIDNO.3)+6-8个C3间臂+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQIDNO.4)，a-2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.18)，b-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.10)，b-2:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改良的序列捕获方法，所述方法包括：1)提取DNA，打断DNA片段大小范围为160bp‑180bp，优选末端修复和3’端加“A”；2)将所述打断的DNA的两端与接头连接，所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6‑8nt的第一标签序列，优选在所述DNA另一端的接头序列远端包括长度6‑8nt的第二标签序列；3)利用所述接头序列的互补序列将所述连接接头的DNA进行Pre‑PCR反应，优选通过所述Pre‑PCR在所述连接接头的DNA两端引入测序接头序列；4)将探针与封闭试剂混合，对所述Pre‑PCR反应进行捕获，所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列，其中所述第一标签序列处用同样长度的C3间臂进行封闭，优选与所述第二标签序列处用同样长度的C3间臂封闭；5)杂交捕获后PCR扩增，利用所述接头序列的互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种改良的序列捕获方法，所述方法包括：1)提取DNA，打断DNA片段大小范围为160bp-180bp，优选末端修复和3’端加“A”；2)将所述打断的DNA的两端与接头连接，所述打断的DNA一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第一标签序列，优选在所述DNA另一端的接头序列远端包括长度6-8nt的第二标签序列；3)利用所述接头序列的互补序列将所述连接接头的DNA进行Pre-PCR反应，优选通过所述Pre-PCR在所述连接接头的DNA两端引入测序接头序列；4)将探针与封闭试剂混合，对所述Pre-PCR反应进行捕获，所述封闭试剂包括与打断的DNA之外的序列互补的封闭序列，其中所述第一标签序列处用同样长度的C3间臂进行封闭，优选与所述第二标签序列处用同样长度的C3间臂封闭；5)杂交捕获后PCR扩增，利用所述接头序列的互补序列。2.根据权利要求1的方法，其中在4)中，所述探针与目标序列互补配对序列一般为160-180bp，优选170bp，用于获取目标区域序列。3.根据权利要求1的方法，其中在4)中，所述探针包括两翼固定长度序列，其长度一般为10-30bp，优选15bp。4.根据权利要求1的方法，其中在2)中，将所述打断的DNA的两端与两个接头分别连接，成线形DNA分子。5.根据权利要求4的方法，其中在2)中，所述接头是：Adapter-1:ACCGAGATCT[标签序列]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.2)，Adapter-2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQIDNO.11)；其中在3)中，将所述带有接头的DNA进行Pre-PCR反应；引物是：PE1.0:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQIDNO.1)；PE2.0:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO.9)[标签序列]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT；其中在4)中，所述探针序列：TGCCTCTTTATCTGT(SEQIDNO.20)+与目标序列配对序列+CATTTCCGATACACC(SEQIDNO.21)所述封闭寡核苷酸序列：a-1:AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT+6-8个C3间臂+GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQIDNO.5)；a-2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQIDNO.9)+6-8个C3间臂+GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO.10)b-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQIDNO.1)+6-8个C3间臂+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡万世，余越美，梁加龙，王瑞超，邵谦之，杭兴宜，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11