一种嗜热属真菌PCR模板的制备方法技术

本申请提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热至少10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。本申请获取嗜热属真菌基因组的方法可以用于嗜热属真菌遗传转化子的PCR鉴定，该方法使用的菌体量小、可缩短转化子的培养时间进而实现在培养早期就可以进行转化子的检测、操作简便快捷、省时省力、经济、且无毒环保，并且后续的PCR灵敏度高，特异性强，为大规模高通量筛选转化子成为可能，以此为基础的快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热属真菌PCR模板的制备方法
本申请提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法。
技术介绍
嗜热属真菌(Thermomyces)是一类适宜在45-50℃下生长的温特殊真菌类群，其分布广泛，从地球的热带、亚热带、温带、寒带以及湿润区和干旱区均发现有存在。嗜热属真菌因其细胞内具有一系列独特的酶和代谢产物，使得其在高温条件下具有独特的生存适应能力。又因为其中的许多酶和代谢产物，例如热稳定酶和生物活性小分子，在生产和生活中具有重要的经济价值，使得嗜热真菌成为当前研究热点。遗传转化是研究生物分子生物学的重要手段。在遗传转化当中，最常规使用的方法主要是通过以转化子的基因组为模板，进行PCR筛选。传统获取真菌DNA基因组模板的方法大都基于CTAB和SDS法，这两种方法需要将大量的菌丝细胞用液氮研磨，不但菌体用量大(50mg以上)，而且操作繁琐且耗时长(1-2个小时)；另外，在提取的过程中用到的苯酚、氯仿等有机溶剂具有一定的毒性，这些因素严重影响了实验进度，不利于大规模高通量筛选转化子，对于嗜热属真菌来说也不例外。如果能开发出一种使用菌体量小且操作快捷的获取嗜热属真菌基因组模板的方法，为大规模高通量筛选转化子成为可能，发掘快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。
技术实现思路
本申请之一提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热8分钟至10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。在一个具体实施方式中，在步骤2)中，加热的温度为97至100℃。在一个具体实施方式中，在步骤2)中，加热的时间为10分钟。在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤2)之后的步骤3)，将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理5分钟以上，优选将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理8至15分钟后，恢复至室温得到冷冻处理的裂解的菌体悬浮液以用作PCR模板使用。例如冷冻处理的温度在-20℃以下。在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤4)，将步骤2)中的所述裂解的菌体悬浮液或步骤3)中的冷冻处理的裂解的菌体悬浮液离心，得到上清液作为PCR模板。在一个具体实施方式中，所述菌丝体与所述TE缓冲液的质量体积比为(0.1mg-10mg)：100μl。在一个具体实施方式中，所述TE缓冲液包括8mM至12mM的Tris-HCl和0.05mM至0.5mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7至8。在一个具体实施方式中，所述TE缓冲液包括10mM至12mM的Tris-HCl和0.1mM至0.2mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7.5至7.8。在一个具体实施方式中，所述嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomycesdupontii)和/或嗜热棉毛菌(Thermomyceslanuginosus)。本申请之二提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌阳性遗传转化子的鉴定方法，其包括如下步骤：以如本申请之一中任意一项所述的方法获取所述嗜热属(Thermomyces)真菌的PCR模板，然后进行PCR筛选。在一个具体实施方式中，还可以对PCR产物进行测序验证分析。本申请的有益效果：经过专利技术人的大量实验性的探索，发现本申请获取嗜热属真菌基因组的方法可以用于嗜热属真菌遗传转化子的PCR鉴定，该方法使用的菌体量小、可缩短嗜热真菌的培养时间至少2至3天，进而实现在培养早期就可以进行嗜热真菌野生型以及突变菌株的检测、操作简便快捷、省时省力、经济、且无毒环保，并且后续的PCR灵敏度高，特异性强，为大规模高通量筛选转化子成为可能，以此为基础的快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。附图说明图1为嗜热杜邦菌NRRL2155的ER基因敲除示意图。图2为敲除ER基因的嗜热杜邦菌NRRL2155的突变菌株PCR检测图。其中，M为2000bp的Marker，从上到下依次为2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp；阴性对照为以采用CTAB法提取嗜热杜邦菌NRRL2155野生菌株的基因组DNA作为模板进行PCR获得产物，标注为WT。图3为实施例3-12的PCR检测图，所有PCR的模板均取自培养3d后的菌丝。其中Marker(即图中的M)的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。图4为实施例13的PCR检测图，其中Marker(即图中的M)的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。图5为对比例1和2的PCR检测图。泳道1为空白对照；泳道2-4依次为对比例1在以0.1mg、2mg、10mg的菌丝量提取的DNA作模板进行的PCR结果；泳道5-7依次为对比例2在培养5d、6d和7d后以10mg的菌丝量提取DNA作模板进行的PCR结果。其中Marker(即图中的M)的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。图6为对比例3以本申请方法和CTAB处理酿酒酵母细胞作模板的进行ITS片段PCR检测图。泳道1为以本申请方法处理后的样品为模板进行的PCR结果，泳道2为CTAB法提取后的样品为模板进行的PCR结果，泳道3为以含有ITS片段的质粒为模板进行的PCR结果。其中Marker的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。具体实施方式下面结合实施例对本申请作进一步说明，但本申请实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本申请的限定。本申请使用的试剂均可常规商业获得。嗜热属真菌嗜热杜邦菌hermomycesdupontiiNRRL2155可购买获得，嗜热棉毛菌ThermomyceslanuginosusYM3-4可从云南生物资源保护与利用国家重点实验室获得，酿酒酵母菌SaccharomycescerevisiaeAH109可购买获得。P缓冲液：MgSO4·7H2O39.435g，柠檬酸钠11.764g，加入150mL蒸馏水溶解后，调pH值＝5.5，定容至200mL。常规高压灭菌。N缓冲液：山梨醇9.105g，柠檬酸钠0.735g，加入30mL蒸馏水，溶解后，调至pH值＝5.8，定容至50mL。常规高压灭菌。STC溶液：山梨醇18.21g，CaCl2·2H2O0.735g，加入60mL蒸馏水，溶解后加入1MTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)5mL，然后定容至100mL。常规高压灭菌。60％PEG4000溶液：12gPEG4000于10mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入蒸馏水定容到20mL。常规高压灭菌。KTC溶液：6.710gKCl溶解于30mL蒸馏水中，然后加入7.5mL1MTris-HCl缓冲液(pH调至8.0)；1.104gCaC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热8分钟至10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。

【技术特征摘要】
1.一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热8分钟至10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，加热的温度为97至100℃。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，加热的时间为10分钟。4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤2)之后的步骤3)，将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理5分钟以上，优选将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理8至15分钟后，恢复至室温得到冷冻处理的裂解的菌体悬浮液以用作PCR模板使用。5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤4)，将步骤2)中的所述裂解的菌体悬浮液或步骤3)中的冷冻处理的裂解的菌体悬浮液离心，得到上清液作为PCR模板。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛雪梅，黄为平，张克勤，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53