一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，该制备方法通过分别对固相基底进行第一氨基化处理、长链修饰、第二氨基化处理来在固相基底的表面形成长链有机接头，然后再接枝可裂解连接物，从而形成固相载体，由此，提供了一套可以高效原位合成核酸的反应体系，从而实现核酸的高效合成。此外，还提供了一种由上述制备方法制备的固相载体以及包括上述固相载体的核酸芯片。通过本发明专利技术的制备方法，可以实现固相基底的有效选择，并且可以进一步提高核酸原位合成的效率和核酸产物的纯度。

A solid phase carrier for in situ synthesis of nucleic acids and its preparation method

The invention provides a preparation method of solid-phase carrier for in-situ synthesis of nucleic acids. The preparation method forms a long-chain organic joint on the surface of solid-phase substrate through first amination treatment, long-chain modification and second amination treatment respectively, and then the branch can split the connector to form solid-phase carrier, thus providing a set of high-efficiency in-situ synthesis The reaction system of synthesizing nucleic acid can realize the efficient synthesis of nucleic acid. In addition, a solid-phase carrier prepared by the preparation method and a nucleic acid chip including the solid-phase carrier are also provided. Through the preparation method of the invention, the solid-phase substrate can be effectively selected, and the efficiency of in-situ synthesis of nucleic acid and the purity of nucleic acid product can be further improved.

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法
本专利技术涉及基因芯片领域，具体地，涉及一种用于核酸原位合成的固相载体及其制备方法。
技术介绍
目前，采用亚磷酰胺法原位合成寡核苷酸已被广泛地使用。在该方法中，需要将待要合成的寡核苷酸3'-端的核苷，经可裂解连接物预先负载在固相载体上，然后将该载体放入反应柱并安装在寡核苷酸自动合成装置上进行自动化合成寡核苷酸。合成步骤如下：(1)利用脱保护试剂将核苷的5'-OH基脱保护；(2)亚磷酰胺核苷单体在活化剂的存在下与暴露出来的5'-OH基团发生偶联反应；(3)通过盖帽试剂将未反应的5'-OH基封上；(4)利用氧化剂将亚磷酸盐氧化。通过重复上述合成循环，来合成具有目的序列的寡核苷酸，利用浓氨水等将可裂解连接物裂解，将最终合成的寡核苷酸从固相载体上切出得到目标寡核苷酸序列。目前，商业化的寡核苷酸合成仪为柱式合成仪，此种仪器合成方法是将商品化的固相无机颗粒载体(例如多孔玻璃(CPG)载体)填充于反应柱中，然后进行自动化合成。随着对原位合成寡核苷酸序列的需要，此种寡核苷酸的柱式合成仪的缺点也越来越凸显，寡核苷酸柱式合成仪主要存在两方面问题：一是由于填充柱的局限性导致了合成仪的通量较小，单位时间内合成寡核苷酸序列种类比较少，已经不能满足目前的市场需求；另一方面是由于现有固相载体CPG制备技术的缺陷导致的。现阶段商品化的CPG载体主要有三部分组成：一是固相基底材料多孔玻璃；二是用于核酸起始步骤合成的带有羟基保护基的可裂解连接物(可以是带有羟基保护基的单体或其它通用结构载体等)；三是用于连接固相基底和可裂解连接物的接头(如：丁二酸酐等)。由于目前商品化的CPG仅在多孔玻璃上实现，受多孔玻璃本身对核酸的吸附作用的影响，利用现有的商品化CPG在寡核苷酸合成过程中，存在寡核苷酸合成链越长，寡核苷酸合成能力降低的缺陷(包括寡核苷酸合成的纯度以及合成效率)。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本申请提出了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，并且提供了相应的固相载体。根据本专利技术的第一方面，提供了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，其中，所述制备方法包括：(1)利用氨基化修饰试剂对固相基底进行第一氨基化处理，得到第一氨基化的固相基底；(2)利用长链接头修饰试剂对所述第一氨基化的固相基底进行修饰，得到长链接枝的固相基底；(3)利用伯氨化处理试剂对所述长链接枝的固相基底进行第二氨基化处理，得到第二氨基化的固相基底；以及(4)将带有保护基的可裂解连接物连接至所述第二氨基化的固相基底，得到固相载体。在上述制备方法中，所述固相基底为硅材质诸如玻璃、石英、陶瓷，或聚苯乙烯，或Fe3O4。在上述制备方法中，单位面积的固相基底所需要的第一氨基化修饰试剂的浓度为0.1％-30％，优选为1％-10％。在上述制备方法中，所述固相基底的形状为微球，并且其中，所述微球的直径为1μm-1000μm，优选为50μm-150μm。在上述制备方法中，所述微球为多孔微球，并且其中，所述多孔微球的孔径为优选为在上述制备方法中，所述接头修饰试剂具有以下结构：其中，R1为羧基(-COOH)，R2为氨基(-NH2)或卤素(-Cl、-Br和-I等)，另外R1与R2之间的碳原子数n≧6。在上述制备方法中，相对于微球状的固相基底的质量，所述接头修饰试剂的用量为100μmol/g-100mmol/g，优选为500μmol/g-5mmol/g。在上述制备方法中，对于片状固相基底，单位玻片表面积所需的接头修饰试剂的用量为10μmol-10mmol，优选为50μmol-5mmol，其中“单位玻片面积”是指一张标准的载玻片(25mm×75mm)的表面积。在上述制备方法中，相对于微球状的固相基底的质量，所述可裂解连接物的负载量为1-150μmol/g，优选为1-100μmol/g。根据本专利技术的第二方面，还提供了一种根据本专利技术的第一方面所述的制备方法制备的固相载体。根据本专利技术的第三方面，还提供了一种核酸芯片，包括根据本专利技术的第二方面所述的固相载体。本专利技术提供了一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，该制备方法通过分别对固相基底进行第一氨基化处理、长链修饰、进行第二氨基化处理来在固相基底的表面形成长链有机接头，然后再接枝可裂解连接物，从而形成固相载体。在本专利技术中，一方面，利用该长链有机接头可连接多种固相基底来实现对固相基底的选择，从而使得可以有效地选择合适的固相基底，进而可选择性地优化核酸原位合成的效率和核酸产物的纯度，并且还通过控制微球形固相基底的形状和孔径来优化进一步优化核酸原位合成的效率和核酸的纯度；另一方面，通过选择合适浓度的氨基化试剂、接头修饰试剂等来对固相基底的长链有机接头进行优化，从而优化固相基底的表面的负载量，以进一步提高核酸原位合成的效率和核酸产物的纯度，在本专利技术中使用长链修饰试剂作为接头修饰试剂来对固相基底的表面进行长链接枝，可以降低了固相基底材料的表面的分子间的电子干扰效应，并且降低化学反应的空间位阻效应，从而进一步提高核酸原位合成的效率和核酸产物的纯度。由此，通过上述制备方法得到了一套可以高效原位合成核酸的反应体系，从而实现核酸的高效合成。通过本专利技术的技术方案克服了现有技术中原位合成核酸技术中的固相载体制备技术的缺陷，例如，连接可裂解连接物的固相基底材料仅局限于多孔玻璃珠，由于受多孔玻璃本身对核酸的吸附作用影响，导致核酸的合成链越长，核酸的合成能力降低，并且同时合成产物的纯度降低的缺陷。本申请通过采用修饰试剂对固相基底进行氨基化处理、长链修饰、第二氨基化处理等来对固相基底进行修饰，来提高固相基底的可选择性，从而提高核酸原位合成的效率，并且提高核酸产物的纯度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施例，下面将对附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是根据本专利技术的一些实施例的用于核酸原位合成的固相载体的制备路径。图2是根据本专利技术的一些实施例的核酸产物的质谱图和相应的纯度数据。图3是对比例的CPG载体合成的核酸产物的质谱图和相应的纯度质谱数据。图4是商品化的CPG载体合成的核酸产物的质谱图和相应的纯度数据。具体实施方式下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述。应理解，所描述的实施方案仅仅是本专利技术的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本专利技术中的实施方案，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施方案，都属于本专利技术保护的范围。目前，商品化的用于核酸原位合成的固相载体主要有三个部分组成：(1)固相基底材料多孔玻璃；(2)用于核酸起始步骤合成的带有羟基保护基的可裂解连接物(可以是带有羟基保护基的单体或其它本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：/n(1)利用氨基化修饰试剂对固相基底进行第一氨基化处理，得到第一氨基化的固相基底；/n(2)利用长链接头修饰试剂对所述第一氨基化的固相基底进行修饰，得到长链接枝的固相基底；/n(3)利用伯氨化处理试剂对所述长链接枝的固相基底进行第二氨基化处理，得到第二氨基化的固相基底；以及/n(4)将带有保护基的可裂解连接物连接至所述第二氨基化的固相基底，得到固相载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸原位合成的固相载体的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)利用氨基化修饰试剂对固相基底进行第一氨基化处理，得到第一氨基化的固相基底；
(2)利用长链接头修饰试剂对所述第一氨基化的固相基底进行修饰，得到长链接枝的固相基底；
(3)利用伯氨化处理试剂对所述长链接枝的固相基底进行第二氨基化处理，得到第二氨基化的固相基底；以及
(4)将带有保护基的可裂解连接物连接至所述第二氨基化的固相基底，得到固相载体。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述固相基底为硅材质诸如玻璃、石英、陶瓷，或聚苯乙烯，或Fe3O4。


3.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其中，单位面积的固相基底所需要的第一氨基化修饰试剂的浓度为0.1％-30％，优选为1％-10％。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中，所述固相基底的形状为微球，并且其中，所述微球的直径为1μm–1000μm，优选为50μm-150μm。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述微球为多...

【专利技术属性】
技术研发人员：王武，郑晖，蔡万世，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11