一种基因组特定区域的DNA测序方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种基因组特定区域的DNA测序方法。本发明专利技术根据参考基因组序列设计多重延伸引物，再以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基，最终根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。本发明专利技术能够发挥MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因型分析手段的优势，适用于精确测定已知基因组序列发生自然或人工突变后的DNA序列信息。此外，本发明专利技术提供的方法还可以应用于变化随机多样的基因编辑产物的序列测定中，该方法不仅可以定性地检测靶标区域是否发生了编辑，也可以对编辑后序列进行精确地测定，而且由于其多重分析的特点，使得对编辑后靶标区域基因型的分析更加高效精准。本发明专利技术相比传统的Sanger测序提高了测序工作的通量、精准度和速度，降低了成本。

【技术实现步骤摘要】
一种基因组特定区域的DNA测序方法
本专利技术属于生物
，具体为一种基因组特定区域的DNA测序方法。
技术介绍
基因组变异是物种性状变化的原因，也是生物适应环境变化的分子基础。此外，人工诱导基因组变异(包括辐射或化学诱变、基因编辑等)能够在物种中产生新的性状变化，从而可以筛选到优异的性状并通过遗传的方式固化下来，这也成为了动植物育种的基本流程。无论是自然突变还是人工突变，测定特定区域的DNA序列成为研究性状变异的分子基础，明确变异分子机制的重要环节。传统的测序方法是通过PCR扩增等方法获得突变的靶标区域，再利用Sanger测序等方法获得具体的DNA序列。然而这种方法通量太低，对于大量样本的序列测定效率有限。而高通量的全基因组测序方式更是成本高昂。基因编辑技术是通过靶定基因组特定目标区域，并对该区域进行随机碱基修饰的技术。通常情况下，基因编辑技术可导致目标区域内出现1个或多个碱基的缺失、替换或插入。因为碱基修饰方式的随机性，无法预测编辑产物的基因型序列信息(CongL，RanFA，CoxD，etal.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems[J].Science，2013，339(6121)：819-23；MaliP，YangL，EsveltKM，etal.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9[J].Science，2013，339(6121)：823-6.)。目前尽管已经开发了诸如PCR/限制性酶切分析、融解曲线分析、特异探针分析和Sanger测序等检测基因编辑产物的方法，但这些技术耗时、费力，很多方法不能准确测定编辑后的序列，严重影响了基因编辑技术的应用范围。此外，由于一次编辑操作会对特定基因组区域产生成百上千种基因型变化，因此迫切需要能够高通量、低成本、精确测定编辑区域序列的方法。MassArray和SNaPshot等技术是近年来发展起来的高通量基因分型工具。MassArray即飞行时间质谱生物芯片系统，是使用质谱分析方法来精确测定PCR产物的非荧光检测平台。质谱分析与终点法PCR相结合，在通用的循环条件下实现了高度多重性的反应，以提供精确、快速且经济高效的分析(LeushnerJandChiuNH.Automatedmassspectrometry：arevolutionarytechnologyforclinicaldiagnostics[J].MolDiagn，2000，5(4)：341-8.)。MassArray系统的基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MAL-DI-TOFMS)技术。基本过程为PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，并在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使延伸引物仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，再用瞬时纳秒强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(time-of-flight，TOF)检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。基于MassArray的分子量阵列平台最高可以设计40多重PCR反应和基因型检测，而且在几秒内就能检测完一个反应孔，因此通量极高；此外，由于质谱仪检测的是分子量这个分子最本质的特征，因此分型结果的准确性很高。此外，MassArray系统还具有实验设计灵活，操作简单、兼容性好、污染率低等一系列优势。MassArray系统已经成为靶向基因型检测的独特解决方案。此外，SNaPshot技术是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，通过在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，将引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型(MakridakisNMandReichardtJK.Multiplexautomatedprimerextensionanalysis：simultaneousgenotypingofseveralpolymorphisms[J].Biotechniques，2001，31(6)：1374-80.)。与MassArray技术类似，SNaPshot也能够运行多重PCR反应体系，从而大幅提高基因分型的通量。然而，传统的MassArray或SNaPshot系统只能对已知的特定一种或多种基因型进行鉴定，对像人工诱变、基因编辑产物这样特定基因组区域但基因型未知的样品，现在的MassArray或SNaPshot系统无法准确获得其基因型DNA序列信息。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种基因组特定区域的DNA测序方法，包括如下步骤：1)根据参考基因组序列设计多重延伸引物；2)以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基；3)根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。具体的，上述特定区域为基因组发生自然或人工突变的位置，突变方式包括但不限于不同种质间的自然突变，人工辐射或化学诱变、基因编辑等；上述的参考基因组为突变发生前的已知基因组序列，包括但不限于某一个特定种质的基因组序列，辐射或化学诱变、基因编辑的受体基因组序列等。具体的，上述述多重延伸引物具体如下：第一重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第一个碱基之前的序列相同，第二重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第二个碱基之前的序列相同，以此类推，直到延伸引物全部覆盖待测区域参考基因组最后一个碱基之前的序列，即第n重延伸引物的序列与待测区域参考基因组倒数第一个碱基之前的序列相同。具体的，CRISPR-Cas9基因编辑产物的待测区域为距离PAM基序第4至第7个碱基。具体的，上述引物延长通过加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)来实现；上述延伸产物序列测定方法采用MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因分型工具检测实现。具体的，上述基因组为玉米基因组。本专利技术提供的方法的优势在于：(1)实验设计简单。本专利技术提供的方法根据已知的参考基因组序列信息设计多重延伸引物，延伸引物覆盖待测区域，再根据延伸产物的序列拼接待测区域的序列。因此实验的设计相对简单，序列拼接仅需要通过简单的多重比对即可实现。(2)测定通量高。一次可以设计几十重PCR反应或基因型检测。可以一次性获得多个突变样本特定区域的DNA序列信息。(3)操作简单、数据准确度高。本专利技术提供的方法延伸产物的测定采用MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因分型工具检测实现。可以更好地发挥这些系统操作简单、数据准确度高的技术优势。具体实施方式提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因组特定区域的DNA测序方法，其特征在于：包括如下步骤：1)根据参考基因组序列设计多重延伸引物；2)以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基；3)根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种基因组特定区域的DNA测序方法，其特征在于：包括如下步骤：1)根据参考基因组序列设计多重延伸引物；2)以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基；3)根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。2.根据权利要求1所述的基因组特定区域的DNA测序方法，其特征在于：所述的特定区域为基因组发生自然或人工突变的位置，突变方式包括但不限于不同种质间的自然突变，人工辐射或化学诱变、基因编辑等；所述的参考基因组为突变发生前的已知基因组序列，包括但不限于某一个特定种质的基因组序列，辐射或化学诱变、基因编辑的受体基因组序列等。3.根据权利要求1所述的基因组特定区域的DNA测序方法，其特征在于：所述多重延伸引物具体如下：第一重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第一个碱基之前的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海军，严建兵，许洁婷，
申请(专利权)人：华中农业大学，未米生物科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42