一种筛选棉花抗旱相关基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选棉花抗旱相关基因的方法。本发明专利技术所提供的方法包括：(1)设置如下实验组和对照组：实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；(2)检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式，找到两组中甲基化水平和/或模式存在差异的基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。本发明专利技术利用MSAP技术分析陆地棉幼苗在干旱胁迫下的甲基化和/或模式变化差异，分析胁迫前后CCGG位点胞嘧啶甲基化水平和/或模式的变化，利用甲基化差异片段来搜索抗旱相关基因，可以为棉花抗旱表观遗传调控机制研究和抗旱相关基因筛选提供依据。

Method for Screening Cotton Drought resistant related gene

The invention discloses a method for Screening Cotton Drought resistant related genes. The method provided by the invention includes: (1) setting as the experimental group and the control group: the experimental group: Test of cotton were treated with drought stress treatment; the control group: the tested cotton were treated with drought stress; (2) to detect and compare the experimental group and the control of genomic DNA methylation level the group tested cotton and / or pattern, find the differences between two groups in gene methylation and / or pattern, namely or candidate for related to drought tolerance of cotton. The difference analysis of Upland Cotton Seedlings under drought stress methylation and / or changes in the mode of using MSAP technology, analysis of the changes of stress before and after the site of CCGG cytosine methylation level and / or the use of differentially methylated fragments to search for genes related to drought tolerance, the mechanisms of epigenetic regulation of gene related to drought resistance and provide the basis for screening of drought resistant cotton.

【技术实现步骤摘要】
一种筛选棉花抗旱相关基因的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，特别涉及一种通过检测经和未经干旱胁迫处理的棉花基因组甲基化水平的变化来筛选棉花抗旱相关基因的方法。
技术介绍
全球气候变化加剧，水资源缺乏，温室效应加剧，土壤盐渍化严重，已严重制约我国农业生产。从世界范围内来看，干旱是影响面积最广，造成经济损失最为严重，被认为是世界上最严重的自然灾害之一。全世界土地28％干旱，我国有2/3土地干旱。随着我国粮棉争地的矛盾日益突出，棉花、马铃薯等经济作物的生产形势起伏不定，不容乐观。针对棉花的抗旱性研究，一直都是国内外学者研究的热点，更是增加棉花单位面积产量、提高棉花品质，解决棉花产能不足的关键所在。据统计，我国旱地总面积约为7.58×107hm2，占我国总耕地面积的73.70％，截止2010年我国共有5.5×105hm2耕地受旱，每年造成的经济损失约占总自然灾害的70％以上。因此，开展干旱胁迫对我国经济作物的影响研究，合理开发利用旱地，对我农业生产和经济发展具有重要战略意义。棉花因具有较强的抗逆性，而被誉为盐碱地的先锋作物。研究棉花的抗旱性，挖掘抗旱相关基因，提高棉花抗逆性，具有重要意义。DNA甲基化是表观遗传学现象的重要内容之一，与动植物的正常生长发育、植物防御、逆境胁迫等许多生命活动有密切联系，在整个生命过程中都发挥着重要作用。在正常情况下，开花被子植物基因组中有20-30％的胞嘧啶残基会发生甲基化，最近研究表明，这个比例还会更高，绝大部分都发生在CG二核苷酸和CNG三核苷酸中，其它位点相对较少。DNA甲基化位点和模式的变化是一个动态变化，会随着植物生长发育，逆境响应等生命过程发生变化。甲基化水平和状态的改变相应的会引起基因表达水平的改变，研究表明，基因转录受甲基化影响，甲基化程度较高的基因会抑制表达，而本身发生去甲基化的基因将会增强表达表达。甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitiveamplificationpolymorphism,MSAP)技术在改良的AFLP的基础上发展起来的一种技术，采用不同的限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ对5′-CCGG-3′位点进行甲基化酶切，两种酶对甲基化敏感性不同，但二者均能识别并切割CCGG序列，可产生不同的切割片段，通过扩增这些切割产物来分析甲基化水平和模式变化。这种方法已经被广泛应用于拟南芥、水稻和棉花等许多其他作物，已经被认为是一种经典的DNA甲基化检测方法。但是关于干旱胁迫诱导陆地棉DNA甲基化变化的报道还鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的筛选与棉花抗旱性相关基因的方法。本专利技术所提供的筛选与棉花抗旱性相关基因的方法，具体可包括如下步骤：(1)设置如下实验组和对照组：实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；所述实验组和所述对照组的差别仅仅在于是否经过干旱胁迫处理，其余所有条件保持一致。(2)检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式，找到两组中甲基化水平和/或模式存在显著性差异的基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。在本专利技术中，所述棉花为陆地棉，具体为陆地棉“中H177”。在所述方法的步骤(1)中，对所述待测棉花进行干旱胁迫处理时选择在棉花幼苗长至三叶一心时期进行，待土壤相对含水量下降至7.0％时完成干旱胁迫处理。在所述方法的步骤(2)中，本专利技术是采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平的。本专利技术采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式时，所用如下：(a1)双酶切组合为EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI。(a2)针对EcoRI的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成；针对HpaII和MspI的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成。(a3)针对EcoRI的预扩增引物为序列表中序列5所示单链DNA分子；针对HpaII和MspI的预扩增引物为序列表中序列6所示单链DNA分子。(a4)针对EcoRI的选择性扩增引物为序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示单链DNA分子；针对HpaII和MspI的选择性扩增引物为序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示单链DNA分子。相应的，预扩增PCR体系采用50μL反应体系，含5μL连接稀释产物、两条预扩增引物分别为1μL(引物浓度为10μM)、2.5UTaq酶、1×PCRbuffer、5μL2.5mMdNTP。预扩增PCR反应程序为：94℃2min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。选择性PCR扩增体系采用20μL反应体系，含2μL预扩增产物、1μL选择性扩增引物(上下游引物各1μL，引物浓度为10μM)、1×PCRbuffer、0.5UTaq酶、2μL2.5mMdNTP。选择性PCR反应程序为：94℃30s(变性)；65℃1min(退火)，72℃1min(延伸)；从第2个循环至第13个循环，退火温度逐次递减，每个循环降低0.7℃；从第14个循环到35个循环退火温度保持在56℃，而其它的程序不变；最后72℃延伸10min。所述方法中，所述找到两组中甲基化水平和/或模式存在差异的基因，具体可为：根据MSAP电泳结果，找到所述实验组和所述对照组中的差异条带，将所述差异条带切割回收测序，根据测序结果，在NCBI数据库进行同源性搜索，找出相应基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。含有如下组合的产品在筛选与棉花抗旱性相关基因中的应用也属于本专利技术的保护范围：(1)限制性内切酶EcoRI、HpaII和MspI；(2)针对EcoRI的接头，以及针对HpaII和MspI的接头；所述针对EcoRI的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成；所述针对HpaII和MspI的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成；(3)针对EcoRI的预扩增引物和针对HpaII和MspI的预扩增引物；所述针对EcoRI的预扩增引物为序列表中序列5所示单链DNA分子；所述针对HpaII和MspI的预扩增引物为序列表中序列6所示单链DNA分子；(4)针对EcoRI的选择性扩增引物和针对HpaII和MspI的选择性扩增引物；所述针对EcoRI的选择性扩增引物为序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示单链DNA分子；所述针对HpaII和MspI的选择性扩增引物为序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示单链DNA分子。本专利技术还请求保护一种用于筛选与棉花抗旱性相关基因的产品。本专利技术所提供的用于筛选与棉花抗旱性相关基因的产品，含有如下：(1)限制性内切酶EcoRI、HpaII和MspI；(2)针对EcoRI的接头，以及针对HpaII和MspI的接头；所述针对EcoRI的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成；所述针对HpaII和MspI的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成；(3)针对Ec本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选与棉花抗旱性相关基因的方法，包括如下步骤：(1)设置如下实验组和对照组：实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；(2)检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式，找到两组中甲基化水平和/或模式存在差异的基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。

【技术特征摘要】
1.一种筛选与棉花抗旱性相关基因的方法，包括如下步骤：(1)设置如下实验组和对照组：实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；(2)检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式，找到两组中甲基化水平和/或模式存在差异的基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述棉花为陆地棉。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式时，双酶切组合为EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式时，针对EcoRI的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成，针对HpaII和MspI的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式时，针对EcoRI的预扩增引物为序列表中序列5所示单链DNA分子，针对HpaII和MspI的预扩增引物为序列表中序列6所示单链DNA分子。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式时，针对EcoRI的选择性扩增引物为序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示单链DNA分子，针对HpaII和MspI的选择性扩增引物为序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示单链DNA分子。8.含有如下组合的产品在筛选与棉花抗旱性相关基因中...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶武威，陆许可，陈修贵，王俊娟，舒娜，王德龙，王帅，樊伟莉，郭晓宁，郭丽雪，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41