用于微量FFPE RNA样本评估的方法、试剂盒及应用技术

本申请公开了一种用于微量FFPE RNA样本评估的方法、试剂盒及应用。本申请的用于微量FFPE RNA样本评估方法，包括选取靶标片段，采用靶标片段的特异性引物和探针，对微量FFPE RNA样本进行实时荧光PCR；并采用标准曲线进行相对定量，获得靶标片段的相对浓度和丰度，以此评估微量FFPE RNA样本的可用性。本申请的方法，打破目前主流检测工具2100Bioanalyzer的局限，采用实时荧光PCR和标准曲线进行相对定量，判断其样本质量，与2100Bioanalyzer方法相比，本申请的方法可直接展示靶标片段的丰度和可用性情况，并且，无需额外购买昂贵的毛细管电泳分析设备，成本更低，更易推广和普及。

【技术实现步骤摘要】
用于微量FFPERNA样本评估的方法、试剂盒及应用
本申请涉及核酸样本质量检测领域，特别是涉及一种微量FFPERNA样本质量检测的方法、试剂盒及应用。
技术介绍
随着新一代测序技术NGS的蓬勃发展，转录组测序技术已成为研究基因表达的主要手段。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带，是基因功能及结构研究的基础和出发点。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。疾病研究和病理分析中，经手术、穿刺及内窥镜钳取等方式获取的新鲜组织样本离开机体后，经固定、脱水、石蜡包埋等步骤制成石蜡块，称为福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-FixedandParaffin-Embedded，缩写FFPE)样本。FFPE样本再经切片、染色等步骤用于病理形态学诊断。制成的FFPE样本由于其性质稳定，在室温条件下可长期贮存，是病案存档及疾病诊断证据的最有效手段，也是疾病相关分析的主要材料来源。采用FFPE样本进行分子生物学检测是辅助诊断及实现个体化医疗的主要手段。但提取自FFPE样本的RNA样本，即FFPERNA样本，其质量普遍不能达到转录组测序实验的基本要求。因此，对快速、准确、高通量的检测FFPERNA样本的质量，提出了更高的要求。在全世界范围内，前列腺癌是第二常见的癌症，也是男性与癌症相关的第五大死因。前列腺癌在84个国家是男性最常见的癌症，且更常发于发达国家，但发展中国家的患病率正在上升。研究显示并非死于前列腺癌的60岁以上男性，约30％至70％已有前列腺癌变。针对前列腺癌的转录组研究需求旺盛，急需成熟、准确的FFPERNA样本质量检测方法，推动转化大量珍贵的临床切片样本进入到下游的分子生物学研究。RIN(RNAIntegrityNumber)是由AgilentTechnologies开发的，用于指示RNA样本质量的工具。RIN适用于2100Bioanalyzer，其计算模型由近1300例人/大鼠/小鼠样本的数据建模得到。RIN的计算参数取自RNA样本电泳的完整轨迹，因此其准确性和可重复性均高于传统的28S/18S等质控方法；又由于RIN是单一的绝对的数值，可避免对于样本质量的因人而异的解读。RIN被认为是检测RNA样本完整性的金标准，然而其应用仍具有多种局限。1)RIN有相对较高的检测浓度阈值，即便使用高敏感度的AgilentRNA6000PicoKit，也需要待测样本浓度达到250pg/μL以上，对于大量珍贵的临床样本实现分子生物学应用来说，无疑是一个巨大的制约因素；2)RIN不能直接预测基因定量实验结果的准确性。RNA的降解是一个逐渐的、非均一的过程，因此RIN并不代表mRNA的完整情况。不同的研究人员或实验设计，会对RIN的要求亦不相同；如Illumina官方建议，在转录组实验中，仅选用RIN≥8的RNA样本；亦有其他研究团队认为，在样本采集过程中，RIN≥6的样本可以认为是高质量的。这种简单的cut-off，缺乏对样本前期处理方法和实验设计的充分了解，会对实验结果及预期造成偏差。3)RIN基本不能对FFPERNA样本质量提供有效的指示作用。由于FFPERNA样本经常是高度碎片化的，RIN对于RNA降解程度的反馈并不灵敏，也因此无法预知所检测样本的建库成功率和数据可信程度。并且，由于FFPERNA样本高度降解，18S和28S通常不可见，这也导致了RIN的参考价值变得局限。4)RIN有严格的适用浓度范围，临床样本通常极为珍贵，常常提取所得RNA无法满足2100Bioanalyzer的最低浓度需求。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的用于微量FFPERNA样本质量检测的方法、试剂盒及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于微量FFPERNA样本评估的方法，包括选取靶标片段，采用靶标片段的特异性引物和探针，对待测的微量FFPERNA样本进行实时荧光PCR检测；并采用标准曲线对实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得微量FFPERNA样本中，靶标片段的相对浓度和相对丰度，以此评估微量FFPERNA样本的可用性。其中，可用性是指微量FFPERNA样本是否可用于后续的RNA测序分析，本申请的微量FFPERNA样本评估，其目的就是判断微量样本是否适用于RNA测序，避免不合格的微量FFPERNA样本进入RNA测序流程，造成不必要的人力和物力损失和浪费。可用性的评估，一方面，根据测定的相对浓度和相对丰度，判断微量FFPERNA样本能否达到RNA测序的核酸量；另一方面，实时荧光PCR也展示了测序的PCR过程，直观的体现了RNA测序的可行性，因为，高度碎片化或存在分子损伤的RNA片段是无法被反转录并扩增产出荧光信号的，对此传统的Qubit分光光度计法或基于RIN的Agilent2100方法都是做不到的，Qubit分光光度计法或Agilent2100方法只能对样本的量和纯度进行检测，而对样本的碎片化或分子损伤则无法检出。可以理解，实时荧光PCR跟RNA测序都是PCR扩增过程，因此，本申请的评估方法如果能够获得较好的结果，证明PCR能够顺利进行，即能够反映化碎片化程度或分子损伤程度，在样本相对定量所测定的量能够满足RNA测序要求的情况，RNA测序也应该能够顺利的进行PCR扩增，即能够得到有效的RNA测序结果。而Qubit分光光度计法或Agilent2100方法只能对样本的量和纯度进行检测评估，并不能展示PCR扩增过程，对于碎片化程度或分子损伤程度也无从检出；因此，即便Qubit分光光度计法或Agilent2100方法检出有足够量的样本，也无法保障RNA测序的顺利进行。其中，靶标片段的选择根据具体检测对象或者所需要评估的对象而定的，例如本申请的一种实现方式中，对前列腺癌的微量FFPERNA样本进行质量评估，其靶标片段就是前列腺癌代表性的基因片段。需要说明的是，本申请的微量FFPERNA样本评估方法，只是对微量FFPERNA样本中靶标片段的相对浓度和相对丰度进行质量评估，至于靶标片段所代表的疾病，或者疾病及其相关信息的检测获取，还需要经过后续的RNA测序才能得到更为详细准确的信息。例如，本申请的一种实现方式中，通过检测前列腺癌的两个关键基因GUSB基因和CDKN1A基因，评估前列腺癌微量FFPERNA样本的质量；但是，这个两个关键基因是否有致病突变，是否导致前列腺癌，还需要进行RNA测序才能知悉。本申请的方法只是负责对微量FFPERNA样本的质量进行评估。可以理解，本申请的微量FFPERNA样本评估的方法，其最终检验的是待测疾病，准确的说是待测疾病的靶标片段的质量；而相对于其它疾病，则需要针对其靶标片段或关键基因，设计特异性引物和探针，按照本申请的方法重新进行评估。还需要说明的是，当使用FFPERNA作为RNA测序的实验材料时，存在两点技术困难：1.FFPE处理会导致RNA高度碎片化，被高度碎片化的RNA片段无法参与下游建库过程；2.FFPE处理会导致RNA在随机位点被化学修饰，这些化学修饰会导致其作为模板时反转录酶或PCR酶的效率降低，进而导致文库构建失败或携带重要生物学意义的信息丢失。现有的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于微量FFPE RNA样本评估的方法，其特征在于：包括选取靶标片段，采用所述靶标片段的特异性引物和探针，对待测的微量FFPE RNA样本进行实时荧光PCR检测；并采用标准曲线对所述实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得所述微量FFPE RNA样本中，靶标片段的相对浓度和相对丰度，以此评估所述微量FFPERNA样本的可用性。

【技术特征摘要】
1.一种用于微量FFPERNA样本评估的方法，其特征在于：包括选取靶标片段，采用所述靶标片段的特异性引物和探针，对待测的微量FFPERNA样本进行实时荧光PCR检测；并采用标准曲线对所述实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得所述微量FFPERNA样本中，靶标片段的相对浓度和相对丰度，以此评估所述微量FFPERNA样本的可用性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准曲线由RNA标准品采用与所述微量FFPERNA样本相同的实时荧光PCR扩增获得。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述RNA标准品为UHRR人标准品。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法在前列腺癌的微量FFPERNA样本的质量评估中的应用。5.一种前列腺癌的微量FFPERNA样本评估的方法，其特征在于：包括选取前列腺癌的关键基因，采用所述关键基因的特异性引物和探针，对待测的微量FFPERNA样本进行实时荧光PCR检测；并采用标准曲线对所述实时荧光PCR检测的结果进行分析，获得所述微量FFPERNA样本中，前列腺癌相关的基因的相对浓度和相对丰度，以此评估所述微量FFPERNA样本的可用性。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述前列腺癌的关键基因包括GUSB基因和CDKN1A基因，所述实时荧光PCR检测为两个基因的多重实时荧光PCR。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述GUSB基因的特异性引物的上下游引物分别为SeqIDNo.1所示序列和SeqIDNo.2所示序列，GUSB基因的特异性探针为SeqIDNo.3所示序列；所述CDKN1A...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗亮，陈翠，刘红笑，徐怀前，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44