发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法技术

本发明专利技术提供一种发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，首先提取植物乳杆菌标准株的DNA，10倍梯度稀释后作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q‑PCR扩增，建立Ct值‑浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；然后提取发酵香肠样品中的菌株总DNA为模板，用植入物杆菌特异性引物进行q‑PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值‑浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。本发明专利技术获得的拷贝数的结果比平板计数高约一个数量级，此外，与通过平板计数与线性方程所得活菌数的吻合度达到94％以上，说明本发明专利技术的方法可用于对植物乳杆菌的直接分析。

【技术实现步骤摘要】
发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法
本专利技术属于菌株计数、定量检测
，特别是一种快速有效的植物乳杆菌定量检测方法。
技术介绍
乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢细菌的总称。乳酸菌作为发酵剂在肉制品发酵中可以缩短产品加工周期，改善产品的品质和风味，提高产品质量稳定性，同时也起到抑制腐败微生物的作用。因此，发酵肉制品中乳酸菌的含量是衡量肉制品质量的重要指标。目前对发酵香肠中乳酸菌数的测定一般都采用传统的平板计数法，这种方法操作误差大、用时长、灵敏度低，无法准确迅速的反应出发酵过程中菌群的动态变化。所使用的选择性培养基会对菌体细胞的灵敏性产生影响，无法对有代谢活力但难以培养的菌体细胞进行计数。实时荧光定量省时、简单，具有很强的特异性和灵敏度，国内外已应用qPCR法对产品中的优势菌和致病菌进行检测，但至今还未有应用此方法对发酵香肠中的植物乳杆菌进行定量。因此，本专利技术具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术缺点，提供一种基于q-PCR手段、计数准确度高的检测方法，能够对植物乳杆菌进行快速定量检测。为了实现上述目的，本专利技术提供一种发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，所述方案包括以下步骤：(1)植物乳杆菌标准株的DNA提取将冻干保存的植物乳杆菌标准株接种至MRS液体培养基中，37℃下培养18h，连续活化增殖三代后，利用试剂盒进行菌株基因组DNA提取，用125μLTEbuffer溶出DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳和ND-1000微紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和光密度值，并将提取的DNA保存在-20℃下备用；(2)标准品的制作将步骤(1)得到的DNA原液的稀释至质量浓度100ng/μL得到扩增模板，用植物乳杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到340bp目标片段；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后在凝胶成像电泳仪的紫外灯下观察电泳结果，切取目的DNA条带，对目的DNA片段回收、纯化后，通过紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和OD260nm/280nm处光密度值；(3)建立Ct值-浓度标准曲线将步骤(1)得到的DNA进行10倍梯度稀释，以所得浓度10-1～10-6的DNA稀释液作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q-PCR扩增，建立Ct值-浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；其中，q-PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；(4)待测发酵香肠样品中菌株总DNA的提取对发酵香肠进行预处理，采用试剂盒提取待测待测发酵香肠样品中菌株的DNA，-20℃保存；(5)待测样品中植物乳杆菌的定量分析以步骤(4)得到的DNA为样品模板，并使用无菌无酶水作为阴性对照模板，采用植入物杆菌特异性引物进行q-PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值-浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。在本专利技术中，所述植物乳杆菌标准株选用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)37x-6，其于2018年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.16189。选择该菌株作为植物乳杆菌标准株的优势在于该菌株具有较高的抑菌活性，在发酵香肠适宜发酵温度20℃条件下，产酸速度快，对盐的耐受能力强，因而适合作为植物乳杆菌定量检测的标准菌株。可选地，在步骤(1)中进行DNA提取时，加入溶菌酶至终浓度为以总体积浓度计70mg/mL，对标准菌株进行破壁。根据一种可选的实施方式，步骤(1)中用于提取菌株基因组DNA的试剂盒是天根试剂盒(TIANampBacteriaDNAKit,Cat.#DP302-02；Lot#P5228)。选择适当的商业化试剂盒进行微生物基因组DNA的提取是本领域的公知常识，因此不再赘述。在本专利技术中，所述特异性引物为：lapF：AGCAGTAGGGAATCTTCCAlapR：CACCGCTACACATGGAG。根据一种优选的实施方式，步骤(2)的扩增体系为：PCRMIX25μL，正向引物和反向引物各2μL，2μLDNA模板，无菌无酶水补充至50μL；反应程序为：95℃预变性7分钟；95℃变性30s，58℃退火1分钟，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。根据一种优选的实施方式，为了验证所述特异性引物的特异性，在步骤(3)中，在最后阶段结束后，从72℃起每隔5s升高0.5℃直至95℃，测量每个温度下的荧光信号，确认每个温度下SYBR染料是否能与双链DNA结合，当SYBR染料与双链DNA结合时表现为发荧光，变性时DNA双链分开，表现为没有荧光产生，复性和延伸时形成双链DNA，SYBR染料发荧光，进行荧光信号的回收。根据一种可选的实施方式，步骤(4)中，采用QIAampDNAStoolMiniKit并参考其说明书提取待测样品中菌株的DNA。根据一种可选的实施方式，步骤(4)中，对发酵香肠的预处理包括：取发酵肉肠220mg于2mL离心管中，在冰上操作；加入1.4mLbufferASL涡旋1min，然后95℃处理5min，再涡旋15s，然后12000rpm离心2min；吸取1.2mL上清液于一新的2mL离心管中，加入1个inhibitEXTablet到样品中，立刻涡旋1min，室温孵育1min使inhibitEXTablet充分吸附抑制物；然后12000rpm离心6min，将所有的上清液转移到1.5mL离心管中，弃去沉淀，然后12000rpm6min。取200μL所得上清液于含有15μL蛋白酶K的1.5mL离心管中，加入200μL的bufferAL，涡旋15S。然后70℃孵育10min，再加入体积浓度为96-100％的200μL的无水乙醇，涡旋混匀；将混匀的溶解液转移到QIAampspincolum柱中，12000离心2min；然后向柱子加入500μLbufferAW1，再12000rpm离心2min；再向柱子加入500μLbufferAW2，12000rpm离心6min，弃去含有离心液的收集管，然后12000rpm离心2min；把上述QIAampspincolum柱转移到新的离心管中，加入200μLAE，12000rpm离心2min，离心管中即为DNA。经过结果对比，本专利技术获得的拷贝数的结果比平板计数高约一个数量级，此外，与通过平板计数与线性方程所得活菌数的吻合度达到94％以上，说明本专利技术的方法可用于对植物乳杆菌的直接分析。【附图说明】图1为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)PCR产物的电泳凝胶结果；图2为植物乳杆菌实时荧光定量PCR的熔解曲线；图3为不同浓度植物乳杆菌标准菌种扩增曲线图；图4为RT-PCR检测香肠发酵过程中乳酸菌数的动态变化(其中，上部数值对应F16组，下部数值对应对照组)；图5为平板计数检测香肠发酵过程中乳酸菌数的动态变化(其中，上部数值对应F16组，下部数值对应对照组)；希望将以上4个图穿插在实施例中。图6为植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，所述方案包括以下步骤：(1)植物乳杆菌标准株的DNA提取将冻干保存的植物乳杆菌标准株接种至MRS液体培养基中，37℃下培养18h，连续活化增殖三代后，利用试剂盒进行菌株基因组DNA提取，用125μL TE buffer溶出DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳和ND‑1000微紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和光密度值，并将提取的DNA保存在‑20℃下备用；(2)标准品的制作将步骤(1)得到的DNA原液的稀释至质量浓度100ng/μL得到扩增模板，用植物乳杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到340bp目标片段；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后在凝胶成像电泳仪的紫外灯下观察电泳结果，切取目的DNA条带，对目的DNA片段回收、纯化后，通过紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和OD260nm/280nm处光密度值；(3)建立Ct值‑浓度标准曲线将步骤(1)得到的DNA进行10倍梯度稀释，以所得浓度10‑1～10‑6的DNA稀释液作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q‑PCR扩增，建立Ct值‑浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；其中，q‑PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；(4)待测发酵香肠样品中菌株总DNA的提取对发酵香肠进行预处理，采用试剂盒提取待测待测发酵香肠样品中菌株的DNA，‑20℃保存；(5)待测样品中植物乳杆菌的定量分析以步骤(4)得到的DNA为样品模板，以无菌无酶水作为阴性对照模板，采用植物乳杆菌特异性引物进行q‑PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值‑浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。...

【技术特征摘要】
1.发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，所述方案包括以下步骤：(1)植物乳杆菌标准株的DNA提取将冻干保存的植物乳杆菌标准株接种至MRS液体培养基中，37℃下培养18h，连续活化增殖三代后，利用试剂盒进行菌株基因组DNA提取，用125μLTEbuffer溶出DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳和ND-1000微紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和光密度值，并将提取的DNA保存在-20℃下备用；(2)标准品的制作将步骤(1)得到的DNA原液的稀释至质量浓度100ng/μL得到扩增模板，用植物乳杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到340bp目标片段；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后在凝胶成像电泳仪的紫外灯下观察电泳结果，切取目的DNA条带，对目的DNA片段回收、纯化后，通过紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和OD260nm/280nm处光密度值；(3)建立Ct值-浓度标准曲线将步骤(1)得到的DNA进行10倍梯度稀释，以所得浓度10-1～10-6的DNA稀释液作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q-PCR扩增，建立Ct值-浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；其中，q-PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；(4)待测发酵香肠样品中菌株总DNA的提取对发酵香肠进行预处理，采用试剂盒提取待测待测发酵香肠样品中菌株的DNA，-20℃保存；(5)待测样品中植物乳杆菌的定量分析以步骤(4)得到的DNA为样品模板，以无菌无酶水作为阴性对照模板，采用植物乳杆菌特异性引物进行q-PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值-浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。2.根据权利要求1所述的快速定量检测方法，其特征在于所述植物乳杆菌标准株是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)37x-6，其于2018年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.16189。3.根据权利要求2所述的快速定量检测方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：田建军，张开屏，杨明阳，赵丽华，靳烨，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15