一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法技术

一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，利用RT‑PCR方法扩增细菌16S rDNA的保守区序列，标准品为含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒，在PCR反应体系中含有200nM正向引物，200nM反向引物，再加入适量模板，通过含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒建立标准曲线，再根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。本发明专利技术方法在阈值设定在10000时，待检测样本CT值

【技术实现步骤摘要】
一种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种检测方法，具体来说是一种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法。
技术介绍
细菌体积小、形状多样、种类繁多、繁殖快、生命力顽强，在基础研究和临床试验中危害极大。细菌污染是细胞培养中常见的污染问题。细菌增殖会消耗营养液，同时产生的毒素会导致细胞表面粗糙，抑制细胞生长，严重时使细胞停止生长，最终导致细胞破裂死亡。此外，致病菌一旦进入人体，会引起多种感染和传染疾病，例如破伤风、伤寒、肺结核等。抗生素能够预防细菌污染及感染，但并不能完全抑制细菌生长，因此对细菌进行实时检测在基础研究和临床试验中尤为重要。根据卫生部制定的一系列标准，几乎所有的细菌检测标准均以传统的细菌培养方法为基础，包括涂片法、分离培养法、生化试验，血清学试验等。传统检测细菌的方法步骤繁琐，工作量大，耗时长，报告结果通常需要5-7d，甚至几周，大大的延缓了细胞上临床的时间。目前有用全自动微生物生化鉴定系统例如梅里埃等检测细菌，是根据生物孔中的生长变化和呈色反应得到结果，该方法操作简单，但仪器成本高，报告结果通常也需要5d。目前还有商业化的快速检测试纸片法，只需培养24h，但该方法易出现假阴性的结果。特异酶的使用、质谱技术、免疫传感器和免疫磁性分离技术特异性高，针对特定的细菌灵敏度高，但广泛性差，对于未知的细菌检测不适用。随着PCR、基因测序等技术的不断进步，细菌检测由最初的表型和化学鉴定演变成分子水平的研究。荧光定量PCR方法因其特异性好、速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为分子生物学研究中的重要工具。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法，所述的这种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法要解决现有技术中检测细菌的方法步骤繁琐、工作量大、耗时长、易出现假阴性的技术问题。本专利技术提供了一种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用RT-PCR方法扩增标准品的16SrDNA部分保守区序列，所述的标准品为含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒，所述的16SrDNA部分保守区序列如SEQIDNO.6所示，采用的正向引物如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或者SEQIDNO.4所示；反向引物如SEQIDNO.5所示；2)在定量PCR反应体系中加入200nM的正向引物，200nM的反向引物，再加入模板；通过测量不同拷贝数的CT值结果，建立拷贝数/μl与CT值的标准曲线；反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃20s，58℃30s，72℃30s；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s；3)利用RT-PCR方法，采用上述的方法扩增待检测样本，根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。具体的，在检测的过程中，待检测样本需要用100℃预处理10min。16SrDNA是原核生物16SrRNA的DNA序列，其序列具有高度的保守性，较强的普遍性。16SrDNA的特点：1、多拷贝，检测敏感性高；2、多信息，由可变区和保守区组成，保守区为大部分细菌所有，可根据保守区设计通用引物，利用可变区设计出细菌特异引物，作为细菌检测最理想的序列。本专利技术采用的标准品为含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒，通过含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒建立标准曲线，通过扩增细菌16SrDNA保守区序列检测样本是否含有细菌，再根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。本专利技术的方法在阈值设定在10000时，如果待检测样本的CT值<35，且Tm在83.6℃-85℃之间为细菌污染，能检测的大肠杆菌浓度极限在3-33cfu/μl之间，能检测的DNA拷贝数极限在1.6×102copies左右，2h即可得出结果。在本专利技术的检测方法中，16SrDNA部分保守区序列具有高度保守性，通过16SrDNA部分保守区序列在NCBI能查出多种菌种，主要包括大肠埃希杆菌、费格森埃希菌、弗氏志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏柠檬酸杆菌等，并能检测出多种细菌，如常见细菌枯草芽孢杆菌(G+)、大肠埃希杆菌(G-)，院感中常见的致病菌金黄色葡萄球菌(G+)、铜绿假单胞菌(G-)。在本专利技术的检测方法中，16SrDNA部分保守区序列具有特异性，不适用于检测非细菌种属的细胞DNA，如人源细胞、大鼠细胞。本专利技术是利用荧光定量PCR技术，通过扩增细菌16SrDNA保守区序列检测细菌的方法。用常见细菌大肠杆菌为例梯度稀释后用涂板、梅里埃检测、荧光定量PCR法检测，将细菌浓度和CT值相关联。本专利技术方法能检测的大肠杆菌浓度极限在3-33cfu/μl之间，检测时间与涂板法相比缩短了15h，与梅里埃检测相比缩短12h。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术建立了一种快速、高效、广泛、高灵敏度、可定量的细菌检测和细菌定量的方法，利用荧光定量PCR技术检测扩增细菌16SrDNA片段，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的方法。不仅可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析，还可通过CT值预测细菌数。本专利技术的方法不需抽提RNA，操作方便，2h即可得出结果。附图说明图1显示了细菌采用荧光定量PCR检测过程中，拷贝数和CT值的标准曲线。图2显示了细菌采用荧光定量PCR检测过程中，稀释倍数和CT值的标准曲线。图3显示了采用菌液涂板检测的方法，检测大肠杆菌的最低浓度。具体实施方式实施例1一、引物和标准品的制备1、本专利技术正向引物：5'-cagcagccgcggtaatac-3'(SEQIDNO.1所示)；或者5'-cagcagccgcggtaattc-3'(SEQIDNO.2所示)；或者5'-cagccgccgcggtaatac-3'(SEQIDNO.3所示)；或者5'-cagccgccgcggtaattc-3'(SEQIDNO.4所示)；或者2、反向引物：5'-ggactaccagggtatctaat-3'。由桑尼公司合成。引物加水溶解至浓度为10μM。3、本专利技术的标准品是含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒，由桑尼公司合成。pUC57碱基数为2710bp。16SrDNA部分保守区序列为ccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgatactggcaagcttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccg(SEQIDNO.5所示)，碱基数为300bp。标准品用TEbuffer溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过扩增16S rDNA保守区序列检测细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用RT‑PCR方法扩增标准品的16S rDNA部分保守区序列，所述的标准品为含有16S rDNA部分保守区序列的pUC57质粒，所述的16S rDNA部分保守区序列如SEQ ID NO.6所示，采用的正向引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示；反向引物如SEQ ID NO.5所示；2)在定量PCR反应体系中加入200nM的正向引物，200nM的反向引物，再加入模板；通过测量不同拷贝数的CT值结果，建立拷贝数/μl与CT值的标准曲线；反应条件分为三个阶段，第一阶段为预变性阶段，95℃10min；第二阶段为PCR反应阶段，95℃20s，58℃30s，72℃30s；第三阶段扩增产物熔解阶段，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s；3)利用RT‑PCR方法，采用上述的方法扩增待检测样本，根据待检测样本的CT值来计算细菌的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种通过扩增16SrDNA保守区序列检测细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用RT-PCR方法扩增标准品的16SrDNA部分保守区序列，所述的标准品为含有16SrDNA部分保守区序列的pUC57质粒，所述的16SrDNA部分保守区序列如SEQIDNO.6所示，采用的正向引物如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或者SEQIDNO.4所示；反向引物如SEQIDNO.5所示；2)在定量PCR反应体系中加入200nM的正向引物，200nM的反向引物，再加入模板；通过测量不同拷...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵简，雷颖，白志慧，张守梅，
申请(专利权)人：同济大学，上海思济细胞技术中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：上海,31