本发明专利技术是一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，包括预测、筛选、转染、提取和酶联免疫吸附实验五个试验过程，通过检测GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞中GH1基因mRNA表达水平和miRNA表达水平，以及采用ELISA实验检测大鼠GH的分泌水平，发现miR‑192‑3p对GH1基因mRNA的表达有抑制作用，能够抑制大鼠GH激素的分泌。
【技术实现步骤摘要】
一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法
本专利技术涉及一种验证miRNA对GH分泌调控作用的方法，尤其是一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，属于生物科技应用领域。
技术介绍
垂体是动物体内最重要的内分泌器官，通过对下游内分泌腺的控制，在众多生理过程中起重要的调节作用。其分泌的多种激素在调节生物活动中其重要作用。GH就是其中一种激素，它能促进全身的生长发育。这是由于它一方面促进骨骼的生长，使身材高大，另一方面促进蛋白质合成使肌肉发达。miRNA是一个非编码的短链RNA，长度在18-23个碱基长度，不论动物还是植物中都扮演着十分重要的角色。其可以通过与mRNA的3’UTR结合，降低mRNA的翻译效率。自Lin-4和Let-7被发现以来，几乎在所有的动物的基因组中都发现了许多miRNA。在以前许多的研究报告中说，miRNA可以影响激素的调节，例如，miR--325-3P可以降低LH的分泌。再比如，miR-26b参与GH的调节。所以为了探究某一miRNA是否能影响GH的分泌调控我们专利技术了这种方法来准确判断它们的关系。
技术实现思路
本专利技术目的在于探究某一miRNA能否影响GH的分泌调控作用，因此研究出这种方法。一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，包括预测、筛选、转染、提取和酶联免疫吸附实验五个试验过程，所述五个试验过程的目的基因为大鼠GH1基因，具体步骤如下：（1）预测可调控GH分泌的miRNA利用Targetscan程序预测出可能与大鼠GH1基因有靶向作用的miR-192-3p；（2）筛选可调控GH分泌的miRNA对步骤1中的miRNA进行双荧光素酶实验，确定可以靶向抑制GH1基因的miR-192-3p；（3）GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞转染实验通过miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC分别对GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞进行转染，整个实验重复三次；（4）RNA的提取和qRT-PCR对步骤（3）中GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞转染结束后的细胞进行RNA的提取和qRT-PCR操作，利用qRT-PCR来检测GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞中GH1基因mRNA表达水平和miRNA表达水平，发现不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH1基因mRNA表达量均下调，转染inhibitors后，GH1基因mRNA表达量均上调，差异显著，证明miR-192-3p对GH1基因mRNA表达有抑制作用；（5）酶联免疫吸附实验，即ELISA收集步骤（3）中原代细胞和GH3细胞系转染结束后的细胞上清液，用大鼠GHELISA试剂盒测定培养液中GH的分泌水平，ELISA实验显示GH激素分泌量不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH激素分泌量均减少，转染inhibitors后，GH激素分泌量均增加，证明miR-192-3p能够抑制GH激素的分泌。优选地，所述双荧光素酶实验由广州市锐博生物科技有限公司进行操作。优选地，所述GH3细胞系来自于国家实验细胞资源共享平台。优选地，所述miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC均采购自广州市锐博生物科技有限公司。优选地，所述步骤（3）中GH3细胞系转染实验采用的培养基为完全培养基，配方为800μL基础培养基D-MEM/F-12＋200μL血清；所述步骤（3）中原代细胞转染实验采用的培养基分别为一号完全培养基和二号完全培养基，其中一号完全培养基配方为1700μL基础培养基D-MEM/F-12＋300μL血清，二号完全培养基配方为425μL基础培养基D-MEM/F-12＋75μL血清。优选地，所述基础培养基D-MEM/F-12型号为hycLone，SH30023.01B，所述血清型号为BI,04-001-1A。优选地，所述步骤（3）转染实验中使用的转染试剂型号为锐博，C10511-05。优选地，所述大鼠腺垂体原代细胞转染实验中，一只大鼠的腺垂体细胞可铺六孔板一个孔，原代细胞转染实验培养4天后，六孔板中一孔细胞可铺二十四孔板4孔。优选地，所述步骤（4）中qRT-PCR使用的反转录试剂盒FastKingcDNA型号为WithgDNase，qRT-PCR使用的PCR仪型号为2720thermaLcycLer。优选地，所述步骤（5）酶联免疫吸附实验中使用的大鼠GHELISA试剂盒型号为mLbio，mL002921。本专利技术的有益效果是：第一、通过检测GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞中GH1基因mRNA表达水平和miRNA表达水平，发现不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH1基因mRNA表达量均下调，转染inhibitors后，GH1基因mRNA表达量均上调，差异显著，证明miR-192-3p对GH1基因mRNA的表达有抑制作用；第二、采用ELISA实验检测大鼠GH的分泌水平,结果显示不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH激素分泌量均减少，转染inhibitors后，GH激素分泌量均增加，证明miR-192-3p能够抑制大鼠GH激素的分泌。附图说明图1为双荧光素酶报告系统结果。图2为GH3细胞系中转染miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC后GH1基因mRNA表达量。图3为GH3细胞系中转染miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC后miR-192-3p的表达量。图4为大鼠腺垂体原代细胞中转染miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC后GH1基因mRNA表达量。图5为大鼠腺垂体原代细胞中转染miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC后miR-192-3p的表达量。图6为GH3细胞系中转染后上清中GH分泌量。图7为大鼠腺垂体原代细胞中转染后上清中GH分泌量。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，包括预测、筛选、转染、提取和酶联免疫吸附实验五个试验过程，所述五个试验过程的目的基因为大鼠GH1基因，具体步骤如下：（1）预测可调控GH分泌的miRNA利用Targetscan程序http://www.targetscan.org/预测出可能与大鼠GH1基因有靶向作用的miRNA；（2）筛选可调控GH分泌的miRNA为了进一步确定可调控GH1基因的miRNA，需经双荧光素酶实验以确定可靶向GH1基因的miRNA,所以将之前预测的miRNA交由广州市锐博生物科技有限公司进行双荧光素酶实验，从而筛选出miR-192-3p可以靶向抑本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，其特征在于：包括预测、筛选、转染、提取和酶联免疫吸附实验五个试验过程，所述五个试验过程的目的基因为大鼠GH1基因，具体步骤如下：（1）预测可调控GH分泌的miRNA利用Targetscan程序预测出可能与大鼠GH1基因有靶向作用的miR‑192‑3p；（2）筛选可调控GH分泌的miRNA对步骤1中的miRNA进行双荧光素酶实验，确定可以靶向抑制GH1基因的miR‑192‑3p；（3）GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞转染实验通过miR‑192‑3p mimics、mimics NC、inhibitors、inhibitors NC分别对GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞进行转染，整个实验重复三次；（4）RNA的提取和qRT‑PCR对步骤（3）中GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞转染结束后的细胞进行RNA的提取和qRT‑PCR操作，利用qRT‑PCR来检测GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞中GH1基因mRNA表达水平和miRNA表达水平，发现不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH1基因mRNA表达量均下调，转染inhibitors后，GH1基因mRNA表达量均上调，差异显著，证明miR‑192‑3p对GH1基因mRNA表达有抑制作用；（5）酶联免疫吸附实验，即ELISA收集步骤（3）中原代细胞和GH3细胞系转染结束后的细胞上清液，用大鼠GH ELISA试剂盒测定培养液中GH的分泌水平，ELISA实验显示GH激素分泌量不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH激素分泌量均减少，转染inhibitors后，GH激素分泌量均增加，证明miR‑192‑3p能够抑制GH激素的分泌。...
【技术特征摘要】
1.一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，其特征在于：包括预测、筛选、转染、提取和酶联免疫吸附实验五个试验过程，所述五个试验过程的目的基因为大鼠GH1基因，具体步骤如下：（1）预测可调控GH分泌的miRNA利用Targetscan程序预测出可能与大鼠GH1基因有靶向作用的miR-192-3p；（2）筛选可调控GH分泌的miRNA对步骤1中的miRNA进行双荧光素酶实验，确定可以靶向抑制GH1基因的miR-192-3p；（3）GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞转染实验通过miR-192-3pmimics、mimicsNC、inhibitors、inhibitorsNC分别对GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞进行转染，整个实验重复三次；（4）RNA的提取和qRT-PCR对步骤（3）中GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞转染结束后的细胞进行RNA的提取和qRT-PCR操作，利用qRT-PCR来检测GH3细胞系和大鼠腺垂体原代细胞中GH1基因mRNA表达水平和miRNA表达水平，发现不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH1基因mRNA表达量均下调，转染inhibitors后，GH1基因mRNA表达量均上调，差异显著，证明miR-192-3p对GH1基因mRNA表达有抑制作用；（5）酶联免疫吸附实验，即ELISA收集步骤（3）中原代细胞和GH3细胞系转染结束后的细胞上清液，用大鼠GHELISA试剂盒测定培养液中GH的分泌水平，ELISA实验显示GH激素分泌量不论在GH3细胞系还是大鼠腺垂体原代细胞中转染mimics后，GH激素分泌量均减少，转染inhibitors后，GH激素分泌量均增加，证明miR-192-3p能够抑制GH激素的分泌。2.根据权利要求1所述的一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，其特征在于：所述双荧光素酶实验由广州市锐博生物科技有限公司进行操作。3.根据权利要求1所述的一种验证miRNA对于大鼠腺垂体GH分泌调控作用的方法，其特征在于：所述GH3细胞系来自于国家实...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁宝，于泽文，任文陟，高巍，陈健，胡进平，权福实，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。