【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法。
技术介绍
1、常规的核酸检测方法有实时荧光定量聚合酶链式反应(qpcr)方法，该方法需要使用精密的仪器设备并配备熟练的专业人员，不易操作且整体耗时较长。向pcr反应体系中加入双链结合染料、数字pcr、微滴式数字化pcr等都依赖荧光读取设备，结果呈现不够直观。还包括基于lamp环等温扩增技术的比浊法，虽然可实现检测结果的可视化，操作简单，但较难应用于pcr等扩增产物量较低的扩增方法，应用范围较为局限，且比浊法对反应体系的透明度要求较高，沉淀物不稳定，扩增需要的引物复杂。在比浊法基础上的指示剂显色法，通过增强阳性样品和阴性对照样品之间的比色效果降低了主观误判的几率。但是，依据指示剂种类不同，存在扩增结束后开管添加增加操作繁琐性造成气溶胶污染，反应体系ph改变产生假阳性等问题。另外，酶促底物显色法，g-四链体作为寡核苷酸，可增强血红素过氧化功能，催化tmb或abts2-底物发生颜色变化，但对环境要求高，dnazyme催化活性会出现下降。而基于纳米金颗粒的可视化检测，目前使用两个修饰有不同dna的纳米金颗粒，在检测不同核酸时需重新设计与修饰纳米金颗粒探针。
2、综上，急需研发一种检测时间短、易于操作且检测结果可视化的新型检测方法，以有效解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就在于提供一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，以解决快速、易操作且结果可视化的检测的问题，实现了不需要对纳米金颗粒修饰特异
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
3、一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，包括以下步骤：
4、a、纳米金颗粒aunps的制备：
5、将10％的氯金酸溶液与去离子水混合后于120℃油浴加热至沸腾时，迅速加入1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热20min，冷却至室温；
6、b、球状核酸sna的制备：
7、将100μm的polyt与50mm的tecp孵育30min后，再加入aunps孵育10min，用正丁醇吸水后弃掉上清，沉淀用tbe缓冲液重悬，再与10mm的三甲基硅烷避光搅拌孵育24h；
8、c、分子信标mb设计及与sna杂交配对的验证：
9、mb核苷酸序列为5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgcagcggccaagagaaggtgaggagggtgtgatgagctgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3'，取1μm的mb与sna混合，95℃加热3min后，取出室温观察为紫色溶液；
10、d、阳性对照目标核酸检测的验证：
11、待检测目标核苷酸链的序列为5'-gacaggcccgaaggaatagaggccaagagaaggtgaggagggtgtgatgaagacgaagcacgagagagag-3'，将上述sna与mb加入含有待测目标核苷酸链的pcr反应体系中，反应10min后，溶液为红色；
12、e、空白对照的验证：
13、将上述sna与mb加入不含目标核苷酸链的pcr反应体系中，反应10min后，溶液依然为紫色。
14、进一步地，步骤a，氯金酸溶液的加入量为400μl，去离子水加入量为98.36ml，柠檬酸钠溶液的加入量为10ml。
15、进一步地，步骤b，polyt的加入量为2.5μl，tecp的加入量为2μl，aunps的加入量为100μl，正丁醇的加入量为900μl，tbe的加入量为100μl，三甲基硅烷的加入量为5μl。
16、进一步地，步骤b，纳米金颗粒直径为13nm。
17、进一步地，步骤c，mb的用量为0.8μl，sna的加入量为10μl。
18、进一步地，步骤c，分子信标mb二级结构为发卡结构，且两端各有一段游离的多聚腺嘌呤核苷酸链poly a。
19、进一步地，pcr反应体系的组分包括：taq dna聚合酶，热稳定flap核酸内切酶1，10倍pcr缓冲液，10μm的上游引物，10μm的下游引物，10mm的脱氧核糖核苷三磷酸，10nm的模板，1μm的分子信标，球状核酸和双蒸水；其中上游引物的序列为5'-gacaggcccgaaggaataga-3'，下游引物的序列为5'-ctctctctcgtgcttcgtct-3'。
20、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
21、本专利技术依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，基于纳米金颗粒的可视化核酸检测，不需要对纳米金颗粒修饰特异性的针对不同靶标核酸的互补寡核苷酸链；不同于常规pcr的反应条件，本方法基本不需要延伸时间，检测时间更短，所需设备相对简单可实现现场便携式及检测结果可视化。
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1.一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于：步骤A，氯金酸溶液的加入量为400μl，去离子水加入量为98.36ml，柠檬酸钠溶液的加入量为10ml。
3.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于：步骤B，polyT的加入量为2.5μl，TECP的加入量为2μl，AuNPs的加入量为100μl，正丁醇的加入量为900μl，TBE的加入量为100μl，三甲基硅烷的加入量为5μl。
4.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于：步骤B，纳米金颗粒直径为13nm。
5.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于：步骤C，MB的用量为0.8μl，SNA的加入量为10μl。
6.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于：步骤C，分子信标MB二级结构为发卡结构，且两端各有一段游离的多聚腺嘌呤核苷酸链poly A。p>
7.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化PCR方法，其特征在于，PCR反应体系的组分包括：Taq DNA聚合酶，热稳定flap核酸内切酶1，10倍PCR缓冲液，10μM的上游引物，10μM的下游引物，10mM的脱氧核糖核苷三磷酸，10nM的模板，1μM的分子信标，球状核酸和双蒸水；其中，上游引物的序列为5'-GACAGGCCCGAAGGAATAGA-3'，下游引物的序列为5'-CTCTCTCTCGTGCTTCGTCT-3'。
...【技术特征摘要】
1.一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，其特征在于：步骤a，氯金酸溶液的加入量为400μl，去离子水加入量为98.36ml，柠檬酸钠溶液的加入量为10ml。
3.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，其特征在于：步骤b，polyt的加入量为2.5μl，tecp的加入量为2μl，aunps的加入量为100μl，正丁醇的加入量为900μl，tbe的加入量为100μl，三甲基硅烷的加入量为5μl。
4.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可视化pcr方法，其特征在于：步骤b，纳米金颗粒直径为13nm。
5.根据权利要求1所述的一种依赖于纳米金颗粒的可...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦虎平，王禹，房恒通，张晶，周博，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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