细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂盒及应用技术

本发明专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂及应用还有试剂盒。本发明专利技术提供的细胞一步法实时定量PCR的方法，方法步骤如下：步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；步骤b、对上述目标细胞内参基因进行跨内含子设计，并检测特异性；步骤c、取步骤a的上清液加入反应体系液进行一步RT‑qPCR检测。将反转录和qPCR试剂和程序合为一步RT‑qPCR。本发明专利技术其中一方面开发了一种裂解细胞且裂解上清可直接用于RT‑qPCR的裂解buffer。此裂解方法相较传统提RNA法具有省时省力、操作难度低、安全隐患小、成本低等优点。此方法可适用于多种实验检测，如单克隆表达差异比较，蛋白或抗体对细胞的生物活性作用等。

【技术实现步骤摘要】
细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂盒及应用
本专利技术属于分子和细胞生物学领域，特别涉及PCR检测。
技术介绍
RT-PCR(Realtime-polymerasechainreaction，实时PCR)是一种体基于PCR技术基础上，发展出来的可以实时检测基因表达水平的方法，现在广泛应用于药物功能鉴定、信号通路研究和体外诊断等多个领域，是检测细胞中基因转录水平的最重要工具。随着生物技术在诊断和医药行业的广泛应用，对于多个病人细胞中的有限基因表达差异的检测、同种靶点多种候选药物对某几个基因表达影响的检测以及生产大分子药物的高转录活跃位点高表达的稳定细胞株都对相对大规模的基因转录水平检测提出了更高的要求。常规的细胞中基因转录水平检测的RT-PCR方法，主要分为三步：第一，RNA抽提；第二，RNA反转录成cDNA；第三，通过荧光染料或探针法进行定量PCR扩增。其中RNA抽提一般是Trizol处理细胞，氯仿抽提，还需要异丙醇和乙醇等多种有机试剂，每次抽提都要耗时几个小时，且所用试剂具有毒性，由于RNA比较容易降解，实验存在不稳定性。综上所述，环境不友好、耗时长、所需试剂多成本高、对操作人员要求较高和操作繁琐等，对于多样本实验可执行性不强。同时RNA抽提需要细胞数量较多，对于样本珍贵的情况更是无法处理。市场上也存在单细胞PCR或测序技术，这些技术难度高、成本高。二代测序可以分析更多的基因，但对于一般候选药物筛选或转录活跃位点筛选，需要检测的基因单一或者较少，但是样本量巨大，二代测序即使成本在下降，也不适用于大样本少量基因表达变化的检测。
技术实现思路
为了解决上述现有各种方法的不足，本专利技术其中一方面开发了一种裂解细胞且裂解上清可直接用于RT-qPCR的裂解buffer、细胞一步法实时定量PCR的方法、配套试剂及应用还有试剂盒。此裂解方法相较传统提RNA法具有省时省力(仅需10～20min)、操作难度低、安全隐患小、成本低等优点。此方法裂解的细胞上清不仅可用于检测正常数量细胞(1000～2000)目的基因表达，而且还适用于检测少量甚至微量细胞(10～100)样本。此方法可适用于多种实验检测，如单克隆表达差异比较，蛋白或抗体对细胞的生物活性作用等。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，该方法步骤如下：步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；步骤b、取步骤a的上清液加入反应体系液进行一步RT-qPCR检测。将反转录和qPCR试剂和程序合为一步RT-qPCR。在一些实施例中还包括对上述目标细胞内参基因进行跨内含子设计，并检测特异性的步骤。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、TritonX-100、RNaseInhibitor和DTT。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，裂解Buffer由水配制，包含5mMTris-Hcl(pH8.0)、1～20mMEDTA、0.1％～2％TritonX-100、0.2～2URNaseInhibitor和0.1MDTT。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，步骤a的步骤如下：提取目标细胞并细胞计数后取细胞至EP管中，离心后弃去上清加入所述一步法裂解Buffer，混匀后室温放置5～10min，离心去除细胞碎片得到上清液。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，反应体系液包含1stStrandcDNASynthesisSuperMix(可以从吴江近岸蛋白质科技有限公司购买)、SYBRqPCRSuperMixPlus(可以从吴江近岸蛋白质科技有限公司购买)、对应引物和DEPC水。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，步骤c还可以包含如下步骤，取所述上清液1ul于8连管中加入所述反应体系液，反应体系液为2ul1stStrandcDNASynthesisSuperMix、5ulSYBRqPCRSuperMixPlus、对应引物包含正向和反向引物各0.5ul和11ulDEPC水，终体积20ul，进行一步RT-qPCR检测。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种细胞一步法实时定量PCR的方法，目标细胞为CHO-DG44细胞，对应引物如下：CHOGAPDH180-F如SEQNo.1：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA；CHOGAPDH180-R如SEQNo.2：GGGTGGGCTTCTTACTCCT；为5’到3’，以下序列未特别说明皆为5’到3’。在目标细胞为Jurkat细胞时对应引物如下：hGAPDH207-F如SEQNo.3；hGAPDH207-R如SEQNo.4；还包含：hIL2-F如SEQNo.5；hIL2-R如SEQNo.6。在目标细胞为产IL-6单克隆抗体的CHODG44细胞(筛选产IL-6抗体的CHODG44的稳定细胞株)，对应引物如下：hIL6A-F如SEQNo.7；hIL6A-R如SEQNo.8。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种用于细胞一步法实时定量PCR的裂解Buffer，包含水、Tris-Hcl、EDTA、TritonX-100、RNaseInhibitor和DTT。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了细胞一步法实时定量PCR的方法的应用，上述任意一种细胞一步法实时定量PCR的方法用于细胞中基因转录水平的检测、细胞的目的基因表达水平的测检、蛋白或抗体对细胞的生物活性作用的检测、单克隆间表达差异的检测。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了细胞一步法实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包含裂解Buffer和反应体系液，裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、TritonX-100、RNaseInhibitor和DTT，反应体系液包含1stStrandcDNASynthesisSuperMix、SYBRqPCRSuperMixPlus、对应引物和DEPC水。本专利技术的细胞一步法实时定量PCR的方法为细胞直接裂解qPCR检测法，简称细胞直接裂解法。本专利技术克服了常规方法的繁琐的RNA抽提步骤，并且将RNA抽提、反转录和定量PCR结合在一起，提高了效率，同时结果与常规方法有较强的一致性。附图说明图1、为本专利技术其一个实施例中为提取RNA后RT-qPCR和本专利技术的细胞直接裂解qPCR检测法结果-扩增曲线和熔解曲线比较图；图2、为本专利技术其中一个实施例中本专利技术的细胞直接裂解法标准曲线图；图3、为本专利技术其中一个实施例中细胞直接裂解法检测blinatumomab抗体对Jurkat细胞激活作用；图4、ELSIA法检测blinatumomab抗体对Jurkat细胞激活作用；图5、本专利技术的直接裂解法的RT-qPCR结果图；图6、为本专利技术其中一个实施例中单克隆细胞培养5天后，15％SDS-PAGE凝胶比较蛋白表达差异图。具体实施方式下述的实施例是为了进一步说明本专利技术的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本专利技术的其他实施例，都属于本专利技术的权利保护范围。下面将结合附图对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述方法步骤如下：步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；步骤b、取所述上清液加入反应体系液进行一步RT‑qPCR检测。

【技术特征摘要】
1.一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述方法步骤如下：步骤a、提取目标细胞加入裂解Buffer，混匀后室温放置后，离心除去细胞碎片得到上清液；步骤b、取所述上清液加入反应体系液进行一步RT-qPCR检测。2.根据权利要求1所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述裂解Buffer包含水、Tris-Hcl、EDTA、TritonX-100、RNaseInhibitor和DTT。3.根据权利要求2所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述裂解Buffer由水配制，包含5mMTris-Hcl(pH8.0)、1～20mMEDTA、0.1％～2％TritonX-100、0.2～2URNaseInhibitor和0.1MDTT。4.根据权利要求3所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述步骤a还可以包含如下步骤：所述提取目标细胞并细胞计数后取细胞至EP管中，离心后弃去上清加入所述一步法裂解Buffer，混匀后室温放置5～10min，离心去除细胞碎片得到上清液。5.根据权利要求1所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述反应体系液包含1stStrandcDNASynthesisSuperMix、SYBRqPCRSuperMixPlus、对应引物和DEPC水。6.根据权利要求5所述的一种细胞一步法实时定量PCR的方法，其特征在于,所述步骤b还可以包含如下步骤，取所述上清液1ul于8连管中加入所述反应体系液，所述反应体系液为2ul1stStrandcDNASynthesisSuperMix、5ulSYBRqPCRSuperMixPlus、对应引物包含正...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛泰根，江华超，石加加，任加庆，臧赢，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32