一种DNA与RNA同时定量的试剂盒、方法及质控方法技术

本发明专利技术涉及一种对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的试剂盒、方法及质控方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术的试剂盒中，核酸包含管家基因，管家基因包含第一内含子和与第一内含子相邻的两个外显子，两个外显子分别为第一外显子和第二外显子；试剂盒包含能够特异性退火至第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物、可与第一内含子杂交的第一杂交探针以及可与第一外显子或第二外显子杂交的第二杂交探针，第一杂交探针和第二杂交探针上带有不同的标记物。本发明专利技术还将DNA与RNA同时定量的测量值与高通量测序检测值进行质控比较，提供了DNA与RNA品质的双质控方法，该方法适用于快速方便地评估样本品质是否适合进行操作及成本都要求较高的高通量测序基因检测。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA与RNA同时定量的试剂盒、方法及质控方法
本专利技术涉及一种DNA与RNA同时定量的试剂盒、方法及质控方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
下一代测序(NGS)技术在过去的十年里彻底改变了基因组学领域。每次NGS运行通常生成关于每次测序运行的并行数十万到数十亿个DNA模板的数千兆序列信息。目前用于人类基因组测序的成本已经达到1000美元的基准。NGS技术的低成本和高通量使得人们能够使用核酸测序作为临床工具。然而，要达到NGS临床应用所需的期望成本、速度、分析灵敏度和准确度，仍然存在许多挑战。临床样本，诸如活检样本和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本，仅提供了少量的起始材料。NGS建库可以使用DNA或RNA做为起始模版，分别适用于不同的基因突变类型的检测。临床样本中的核酸往往由于长期在室温存放，其中的核酸特别是RNA大量降解，使RNA模版建库变得困难。临床常用的对样本进行福尔马林固定的处理过程使核酸产生交联或破坏，使得NGS建库效率下降并使检测结果背景增高。因此，在耗费大量时间和成本构建NGS文库前快速方便地对DNA和RNA模版进行含量和质量评估是必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于DNA与RNA同时定量的试剂盒、方法与试剂盒以及DNA与RNA的品质控制方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的试剂盒，其中，所述核酸包含管家基因，所述管家基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，两个所述外显子分别为第一外显子和第二外显子；所述试剂盒包含能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物、可与第一内含子杂交的第一杂交探针以及可与第一外显子或第二外显子杂交的第二杂交探针，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有不同的标记物。优选地，所述试剂盒还包含PCR反应液和反转录反应液。优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、脱氧核苷酸、无机盐和pH缓冲液；所述反转录反应液包括反转录酶、脱氧核苷酸、无机盐和pH缓冲液。优选地，所述试剂盒还包括随机引物或与mRNApolyA尾互补的poly-dT多聚核苷酸引物。优选地，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有发光波长不同的发光基团。优选地，所述发光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、TET或VIC。优选地，如下(a)～(e)中的任一种：(a)所述核酸包含基因组DNA或其片段；(b)所述核酸包含RNA；(c)所述核酸包含cDNA或其片段,优选地，所述cDNA通过逆转录总RNA、mRNA、miRNA或其他非编码RNA获得；(d)所述核酸包含基因组DNA和RNA；(e)所述核酸包含基因组DNA和cDNA。优选地，所述样本来源于血液样本、细胞样本、组织样本、食物样本、环境样本或生物样本。优选地，所述试剂盒还包括试剂盒的使用说明书。第二方面，本专利技术提供了一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的方法，其包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的RNA转化为cDNA；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行PCR扩增，得到扩增子；(3)检测第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中DNA与RNA进行定量，定量的方法为：分别记录第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的Ct值，通过Ct值的绝对值以及差值分析样本中DNA与RNA的品质；其中，所述Ct值为标记物所产生信号达到设定检测阈值时对应的扩增循环数。第三方面，本专利技术提供了另一种采用上述试剂盒对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的方法，其包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的RNA转化为cDNA；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行PCR扩增，得到扩增子；(3)以所述核酸为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行PCR扩增；(4)分别检测步骤(2)与步骤(3)中第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中DNA与RNA进行定量，定量的方法为：分别记录步骤(2)与步骤(3)中第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的Ct值，通过步骤(3)中第一杂交探针和/或第二杂交探针上标记物的Ct值分析样本中DNA的品质，通过步骤(2)中第一杂交探针上标记物的Ct值与步骤(3)中第一杂交探针上标记物的Ct值之差分析样本中RNA的品质；其中，所述Ct值为标记物所产生信号达到设定检测阈值时对应的扩增循环数。第四方面，本专利技术提供了一种对含有核酸的样本中DNA与RNA进行质控的方法，其包括以下步骤:从核酸中选取一个内参基因，所述内参基因包含碱基数小于300的第一内含子、碱基数大于300的第二内含子、与所述第一内含子相邻的两个外显子和与所述第二内含子相邻的两个外显子；或者从核酸中选取两个内参基因，其中一个内参基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，另一个内参基因包含碱基数大于300的第二内含子和与所述第二内含子相邻的两个外显子；其中，与第一内含子相邻的两个外显子分别为第一外显子和第二外显子，与第二内含子相邻的两个外显子分别为第三外显子和第四外显子；以含有第一内含子的内参基因作为管家基因，采用权利要求10～13任一项所述方法对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量；第三外显子边缘的一条建库引物用于以所述核酸为模版的RNA单端锚定建库；以第二内含子与第三外显子交界区的碱基测序读数计量内参基因的DNA扩增产物，以第四外显子的测序读数计量内参基因的RNA扩增产物，以两个测序读数的比例判断NGS文库的RNA建库质量；根据DNA与RNA同时定量的结果以及判断NGS文库的RNA建库质量的结果，综合分析样本中DNA与RNA的品质。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种用于DNA与RNA同时定量的方法与试剂盒，采用该试剂盒与方法可同时分析DNA与RNA。并且，本专利技术还将DNA与RNA同时定量的测量值与高通量测序检测值进行质控比较，提供了DNA与RNA品质的双质控方法，该方法适用于快速方便地评估样本品质是否适合进行操作及成本都要求较高的高通量测序基因检测。附图说明图1为本专利技术对含有核酸的样本中DNA与RNA进行质控的方法示意图；图2为本专利技术实施例3中将反转录定量PCR的外显子探针与内含子探针的Ct差值与NGS测序内参基因RNA对DNA读数比例作图的结果图；图3为本专利技术实施例3中将反转录定量PCR与无反转录定量PCR的外显子探针的Ct差值与NGS测序内参基因RNA对DNA读数比例作图的结果图；图4为本专利技术实施例3中将使用Qubit定量的RNA与DNA浓度的比例与NGS测序内参基因RNA对DNA读数比例作图的结果图；图5为本专利技术实施例3中将使用Qubit定量的RNA浓度与NGS测序内参基因RNA对DNA读数比例作图的结果图。具体实施方式在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的试剂盒，其特征在于，所述核酸包含管家基因，所述管家基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，两个所述外显子分别为第一外显子和第二外显子；所述试剂盒包含能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物、可与第一内含子杂交的第一杂交探针以及可与第一外显子或第二外显子杂交的第二杂交探针，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有不同的标记物。

【技术特征摘要】
1.一种对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的试剂盒，其特征在于，所述核酸包含管家基因，所述管家基因包含碱基数小于300的第一内含子和与所述第一内含子相邻的两个外显子，两个所述外显子分别为第一外显子和第二外显子；所述试剂盒包含能够特异性退火至所述第一外显子和第二外显子的核酸序列的扩增引物、可与第一内含子杂交的第一杂交探针以及可与第一外显子或第二外显子杂交的第二杂交探针，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有不同的标记物。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应液和反转录反应液，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、脱氧核苷酸、无机盐和pH缓冲液；所述反转录反应液包括反转录酶、脱氧核苷酸、无机盐和pH缓冲液。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括随机引物或与mRNApolyA尾互补的poly-dT多聚核苷酸引物。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一杂交探针和第二杂交探针上带有发光波长不同的发光基团。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述发光基团为FAM、ROX、HEX、CY5、TET或VIC。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，如下(a)～(e)中的任一种：(a)所述核酸包含基因组DNA或其片段；(b)所述核酸包含RNA；(c)所述核酸包含cDNA或其片段,优选地，所述cDNA通过逆转录总RNA、mRNA、miRNA或其他非编码RNA获得；(d)所述核酸包含基因组DNA和RNA；(e)所述核酸包含基因组DNA和cDNA。7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本来源于血液样本、细胞样本、组织样本、食物样本、环境样本或生物样本。8.一种采用权利要求1～7任一项所述试剂盒对含有核酸的样本中DNA与RNA同时定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取所述管家基因，以所述核酸为模板进行反转录，使核酸中的RNA转化为cDNA；(2)以步骤(1)反转录后的产物为模板，以所述扩增引物为引物，同时加入所述第一杂交探针和第二杂交探针，进行PCR扩增，得到扩增子；(3)检测第一杂交探针和第二杂交探针上标记物所产生的信号，对含有核酸的样本中DNA与RNA进行定量，定量的方法为：分别记录第一杂交探针和第二杂交探针上标记物对应的Ct值，通过Ct值的绝对值以及差值分析样本中DNA与RNA的品质；其中，所述Ct值为标记物所产生信号达到...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈力，郑宗立，高彦秋，何云蔚，陈淼，赖家嘉，
申请(专利权)人：深圳恒特基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44