本发明专利技术涉及一种用于处理片段化DNA的新型快速补平加腺嘌呤试剂，配置该试剂1个反应的基本配方是10倍浓缩T4核酸连接缓冲液1-5ul，10mM寡核苷酸1-5ul，100mM三磷酸碱基脱氧核苷酸0.05-0.5ul，T4核酸聚合酶0.05-0.5ul，T4磷酸化激酶0.5-2ul，Taq核酸聚合酶0.05-0.5ul，溶于超纯水。使用该试剂的基本流程是片段化DNA加入该新型快速补平加腺嘌呤试剂，放置PCR仪上12℃15分钟，25℃15分钟，72℃30分钟。本发明专利技术的补平加腺嘌呤试剂成分简单，成本低廉，制备操作简易，并且可以将传统的补平加腺嘌呤的两步操作合并为一步，减少样本损失，缩短样本制备时间，降低样本出发量要求，可以明显将样本出发量由原先的1000ng降低为50ng以下，并且降低样本制备时间由原先3.5小时缩短至90分钟内。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及用于DNA
，特别是指一种用于处理片段化DNA的新型快速补平加腺嘌呤试剂及方法。
技术介绍
DNA是人类遗传的物质基础，为了弄清DNA在人类遗传和发育过程中的功能和结构，DNA序列的检测成为了研究DNA最重要的手段。1977年Sanger专利技术了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和I Gilbert专利技术了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了第一代DNA测序的主流。随着科学技术的不断革新，第一代DNA测序技术(Sanger)已无法满足测序的需求，1990年，美国正式启动跨世纪的〃人类基因组计划〃，计划历时15年，斥资30亿美元，破译人类自身遗传秘密，人类步入了后基因组时代。随着对DNA信息的海量需求，二代测序诞生了，该技术基于一项边合成边测序技术，代表公司有Roche (454)，Illumina (Solexa), ABI (SOLID)。二代测序技术最基本的技术就是二代测序文库的构建，文库构建起始首先将待测样本的基因组DNA进行破碎和片段化，主要手段有剪切力，超声波，氮气，酶切等，在获得片段化DNA之后，为了方便加上不对称的测序接头，必须先将片段化DNA做末端补平和尾端加单个腺嘌呤，经典文库构建流程中末端补平和尾部加腺嘌呤的步骤是独立完成的。随着二代测序技术的飞速发展，该技术也被广泛用于遗传性突变，疾病发病机理，遗传机理等多种医学，遗传学等医疗领域。在医疗领域中，科研人员需从各种不同的组织标本中提取DNA，但新鲜组织标本来源有限，所以通常临床样本都采用石蜡包埋方式处理组织，导致获得的DNA量通常都会偏少，很难达到经典文库构建流程的最低起始量lOOOng，低起始量已经成为制约二代测序技术应用于医疗领域的制约因素，因此改进片段化DNA末端补平和加腺嘌呤的方法将起始量降低已成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上现状，解决限制二代测序技术在医疗领域上的瓶颈问题，提供一种用于处理片段化DNA的新型快速补平加腺嘌呤试剂及方法，该试剂成分简单，制备操作方便，成本低廉，不需特殊设备，并能显着降低起始DNA量和样本制备时间。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下: 一种用于处理片段化DNA的新型快速补平加腺嘌呤试剂，其特征在于，配置该试剂I个反应的基本配方是10倍浓缩T4核酸连接缓冲液l_5ul，10mM寡核苷酸l_5ul，10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸0.05-0.5ul，T4核酸聚合酶0.05-0.5ul，T4磷酸化激酶0.5_2ul，Taq核酸聚合酶0.05-0.5ul，溶于超纯水。更适宜的是，所述10倍浓缩T4核酸连接缓冲液2.5ul，10mM寡核苷酸I ul，10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸0.5ul，T4核酸聚合酶0.5ul，T4磷酸化激酶0.75ul，Taq核酸聚合酶0.5ul，溶于超纯水。—种用于制备上述的新型快速试剂的方法，其特点是，包括以下步骤: 准确使用移液器量取所述10倍浓缩T4核酸连接缓冲液，所述1mM寡核苷酸，所述10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，所述T4核酸聚合酶，所述T4磷酸化激酶，所述Taq核酸聚合酶。上述步骤中的所有成分使用超纯水定容至9ul。一种使用所述新型快速试剂进行片段化DNA快速末端补平和加腺嘌呤的方法，其操作步骤包括: 取I个0.2ml PCR管，将介于50ng至100ng的片段化DNA准确定容至16ul加入该PCR管内，再准确加入新型快速补平加腺嘌呤试剂9ul ; 使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上； 将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上； 运行正确的反应程序。更适宜的是，以上所述正确的反应程序，所指具体程序是12°C 15分钟，25°C 15分钟，72°C 30分钟。—种利用所述新型快速补平加腺嘌呤方法的检测方法，其特征在于:将新型快速补平加腺嘌呤所得产物，直接加入连接体系放置PCR仪上孵育，所得产物进行磁珠纯化，再加入PCR扩增液放置PCR仪上进行扩增，所得扩增产物进行磁珠纯化，最后使用荧光标记物对产物进行定量。更适宜的是，所述连接体系，其具体成分为T4核酸连接酶3ul，双链接头Iul，超纯水Iul，所述PCR仪上孵育条件为22°C I小时，所述磁珠纯化成分为羧基磁珠，所述PCR扩增液为高保真PCR聚合酶混合液12.5ul，引物混合液2ul。更适宜的是，所述PCR上进行扩增条件为第一步:95°C 30秒；第二步:95°C 30秒，65°C 30秒，72°C 30秒；第三步:重复第二步10次；以及第四步:72°C 4分钟。更适宜的是，所述焚光标记物指的是Qubit核酸高精度定量试剂。本专利技术的片段化DNA新型快速补平加腺嘌呤的试剂组成成分为:10倍浓缩T4核酸连接缓冲液，1mM寡核苷酸，10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，T4核酸聚合酶，T4磷酸化激酶，Taq核酸聚合酶均为分子生物学中最为常见的酶和缓冲液，原料易得，价格低廉，有利于推广应用； 配置本专利技术的新型快速补平加腺嘌呤试剂只需将上述原料溶于超纯水，制备简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备。采用本专利技术的新型快速补平加腺嘌呤试剂进行片段化DNA补平和加腺嘌呤，大大降低了所需片段化DNA的起始量，大大节约了操作时间和操作难度，使用本专利技术的新型快速补平加腺嘌呤方法，片段化DNA起始量可低至50ng，是经典方法的1/20，所需制备时间仅需90分钟，是经典方法的40%。【附图说明】图1是各实施例中产物浓度与DNA出发量的关系示意图；图2是各实施例中产物浓度与耗时的关系示意图。【具体实施方式】本专利技术将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的，并非用以限制本专利技术。在对实例描述前，有必要提供一些备注说明: 采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验室，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。实施例1 配置试剂: 准确使用移液器量取10倍浓缩T4核酸连接缓冲液2.5ul，10mM寡核苷酸I ul，10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸0.5ul，T4核酸聚合酶0.5ul，T4磷酸化激酶0.75ul，Taq核酸聚合酶0.5ul，并使用超纯水定容至9ul。实验操作过程: A.取I个0.2ml PCR管，将片段化DNA 50ng准确定容至16ul加入该PCR管内，再准确加入新型快速补平加腺嘌呤试剂9ul。B.使用移液器吸头将该管内混合物均匀吹打混合10次以上。C.将装有混合均匀的混合物PCR管放置于PCR仪上。D.运行正确的反应程序。反应程序是:12°C 15分钟，25°C 15分钟，72°C 30分钟。检验方法: 将所得产物直接加入双链接头lul，T4核酸连接酶3ul，22°C孵育I小时，用1:1体积比羧基磁珠进行纯化，洗脱体积10.5ul，加入12.5ul高保真PCR聚合酶缓冲液12.5ul，引物混合液2ul，所得终产物用1:1体积比羧基磁珠进行纯化，洗脱体积20ul。使用Qubit核酸高精度定量试剂进行荧光定量。最后测得终产物浓度为:21.2 ng/ul，实验总本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于处理片段化DNA的新型快速补平加腺嘌呤试剂，其特征在于，配置该试剂1个反应的基本配方是10倍浓缩T4 核酸连接缓冲液 1‑5ul，10mM 寡核苷酸 1‑5ul，100mM 三磷酸碱基脱氧核苷酸 0.05‑0.5ul，T4核酸聚合酶 0.05‑0.5ul，T4磷酸化激酶 0.5‑2ul，Taq核酸聚合酶 0.05‑0.5ul，溶于超纯水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏冬凯，裘锋，徐康萍，
申请(专利权)人：苏州贝斯派生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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