一种DNA pulldown方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种DNA pulldown方法及试剂盒。所述方法包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown；S5、蛋白样品的收集。本发明专利技术具有如下有益效果：本发明专利技术通过预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白、基因组DNA的非特异性结合。本发明专利技术通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于研究DNA与蛋白相互作用的DNA pulldown方法及试剂盒。
技术介绍
随着功能基因组学的兴起，蛋白质-DNA相互作用的研究变得越来越重要。蛋白质-DNA相互作用涉及很多生物学功能，如基因调节、DNA修复和DNA重组(ROHS R,JIN X,WEST S M,et al.2010.Origins of specificity in protein-DNA recognition.Annu Rev Biochem[J],79:233-269)。现有研究DNA-蛋白相互作用的技术方案有多种，如酵母单杂交(Y1H)方法、ChIP-seq方法、凝胶迁移实验(EMSA)和DNA pulldown方法。DNA pulldown方法是一种非常重要的蛋白质-DNA相互作用的研究方法。该方法可以在同一个样品中分离DNA-蛋白复合体。通常，是通过高亲和性的标签(如生物素)标记DNA，标签的目的是固定DNA，通过琼脂糖珠子或磁珠可以分离出生物素化的DNA，从而分离出细胞裂解液中的DNA-蛋白复合体。分离出的蛋白进行洗脱后可以通过Western Blot进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：将步骤S3制备的蛋白样品加入到步骤S2制备的探针‑磁珠复合物中，加入DNA precipitation buffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNA precipitation buffer洗涤磁珠，得到蛋白‑探针‑磁珠复合物；S5...

【技术特征摘要】
1.一种DNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：将步骤S3制备的蛋白样品加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入DNA precipitation buffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNA precipitation buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；S5、探针-蛋白复合物的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针-蛋白复合物。2.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。3.根据权利要求2所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L。4.根据权利要求1或2所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。5.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：向2-5μg DNA探针中加入DNA structure buffer至100μL，再将其加入步骤S1中预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。6.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S3中预处理细胞核蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的核蛋白提取物中加入5μL DNase和1.6μL DNase Buffer，25℃温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；上清液为预处理的核蛋白。7.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S3提取细胞核蛋白的方法为：用含0.5mM PMSF的PBS洗涤1.5×107个细胞两次，每次4℃、1000rpm离心5min，弃上清；加入390μL预冷Buffer 1、4μL 10mg/mL的PMSF溶液、4μL protease inhibitor cocktail和2μL 100mM DTT溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；4℃、1400g-2500g离心5min，弃上清；加入390μL冷Buffer ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓香，董先辉，张娟，曾健，周剑，
申请(专利权)人：广州伯信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44