【技术实现步骤摘要】
一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板检测基因变异的方法
本专利技术涉及基因变异检测
,尤其是一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板进行高通量测序检测基因变异的方法。
技术介绍
真核生物的基因由外显子及内含子交替组成。内含子占基因序列的大部分,以ALK基因为例,全长为728kb(千碱基,以下同),其中外显子为6kb,其余为内含子序列。基因通过转录反应合成前体RNA(hnRNA),再通过剪切反应去除内含子序列,使外显子拼接成为信使RNA(mRNA),用于翻译合成蛋白(如图4)。肿瘤的基因变异可大致划分为:单碱基置换突变(SNV)、插入/缺失突变(Indel)、DNA拷贝数变异(CNV)、基因融合、RNA表达量差异。单碱基置换突变及插入/缺失突变合称突变,在肿瘤中最为常见,如单是EGFR一个基因的突变就占到中国肺癌患者的约40%。基因融合,又称染色体重排或易位,是正常基因组中位于不同区域的两个或以上序列发生断裂重组从而拼接成一段新的序列。一些特殊的变异,如一段序列的倒置,或基因的异常剪切,也可被归为融合。基因融合是一种常见的肿瘤发生机制,也是靶向治疗的重要靶点,如肺癌中多发的EML4-ALK基因融合,为克唑替尼的作用靶点。高通量测序技术在过去的十年里彻底改变了基因组学领域。每次运行可并行获得数百万条以上的序列信息。靶向测序是指针对指定的靶标区域进行的高通量测序,提供了具有适当广度和深度的测序数据,从而允许检测临床相关的基因变异。肿瘤基因变异的复杂性决定了靶向测序是有效发现变异的手段,针对的靶标区 ...
【技术保护点】
1.一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板进行高通量测序检测基因变异的方法,包括如下步骤:/n1)提供含有基因组DNA和信使RNA的核酸样本,通过反转录使得核酸样本中的信使RNA转化为双链的cDNA,得到含有双链cDNA及基因组DNA的核酸样本;/n2)将步骤1)所得含有双链cDNA及基因组DNA的核酸样本打断,得到随机分布的核酸片段;/n3)连接文库接头至步骤2)所得核酸片段,得到连接产物;/n4)将步骤3)所得连接产物与第一引物池和DNA聚合酶混合,连接产物经高温解聚成两条单链核酸,其中一条含有靶标序列的单链与第一引物经退火结合,并延伸反应至文库接头的单链末端,得到一条以含有文库接头和靶标序列的核酸为模板的单链复制产物;/n5)重复至少一次与步骤4)相同的变温循环,得到多条所述单链复制产物;/n6)将步骤5)所得单链复制产物与通用接头引物、适配引物和第二引物池混合,进行PCR扩增获得测序用文库,文库中序列结构依次为测序芯片的第一结合序列—文库接头—靶标序列—第二引物共同序列—测序芯片的第二结合序列,其中,所述通用接头引物的5’端包含一段对应于测序芯片的第一结合序列,3’端包含一段 ...
【技术特征摘要】
1.一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板进行高通量测序检测基因变异的方法,包括如下步骤:
1)提供含有基因组DNA和信使RNA的核酸样本,通过反转录使得核酸样本中的信使RNA转化为双链的cDNA,得到含有双链cDNA及基因组DNA的核酸样本;
2)将步骤1)所得含有双链cDNA及基因组DNA的核酸样本打断,得到随机分布的核酸片段;
3)连接文库接头至步骤2)所得核酸片段,得到连接产物;
4)将步骤3)所得连接产物与第一引物池和DNA聚合酶混合,连接产物经高温解聚成两条单链核酸,其中一条含有靶标序列的单链与第一引物经退火结合,并延伸反应至文库接头的单链末端,得到一条以含有文库接头和靶标序列的核酸为模板的单链复制产物;
5)重复至少一次与步骤4)相同的变温循环,得到多条所述单链复制产物;
6)将步骤5)所得单链复制产物与通用接头引物、适配引物和第二引物池混合,进行PCR扩增获得测序用文库,文库中序列结构依次为测序芯片的第一结合序列—文库接头—靶标序列—第二引物共同序列—测序芯片的第二结合序列,其中,所述通用接头引物的5’端包含一段对应于测序芯片的第一结合序列,3’端包含一段与文库接头单链结构末端相同的序列,所述适配引物5’端包含一段对应于测序芯片的第二结合序列,3’端包含一段与第二引物共同序列相同的序列;
7)将步骤6)所得文库进行高通量测序,分析所述靶标序列是否发生了融合或/和突变。
2.权利要求1的方法,其中,所述第一引物根据核酸模板设计,包括以下几种类型:
a、一条结合于靶标基因的外显子并指向潜在的融合拼接点的引物,用于从信使RNA模板检测该方向发生的融合;
b、一条结合于靶标基因的内含子且延伸方向指向临近外显子的引物,用于从基因组DNA模板检测所述外显子的突变;
c、一组结合于靶标基因的内含子并指向潜在的融合拼接点的引物,该组引物堆叠设置从而覆盖整个内含子,用于从基因组DNA模板检测该方向发生的融合。
3.权利要求1或2的方法,其中:
(1)各类型的所述第一引物为多重引物,针对不同的靶标序列;
(2)所述第一引物的5’端包括一段第一引物共同序列,第一引物共同序列长度为至少13个碱基且不与靶标基因结合;
(3)所述第一引物池含有a类型第一引物,以及b类型和/或c类型第一引物;
(4)所述第二引物池含有与第一引物池中类型相同的第二引物,可选地,所述第二引物相对于第一引物是嵌套的,更优选地,所述第二引物的方向与第一引物相同,所述第二引物3’端位置位于第一引物3’端的下游,且第二引物3’端距离第一引物3’端至少3个碱基,第二引物的5’端位置与第一引物5’端位置相同或位于第一引物下游;
(5)所述第二引物5’端包括一段第二引物共同序列,所述第二引物共同序列长度为至少13个碱基且不与靶标基因结合。
4.权利要求1的方法,其中,所述步骤3)中文库接头由两条部分序列互补的单链寡核苷酸组成,两条单链的互补部分构成一个双链结构,非互补部分构成单链结构,
可选地...
【专利技术属性】
技术研发人员:郑宗立,陈力,
申请(专利权)人:深圳恒特基因有限公司,
类型:发明
国别省市:广东;44
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