【技术实现步骤摘要】
基于突变-编码文库的高通量筛选方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种基于突变-编码文库的高通量筛选方法。
技术介绍
基因突变(genemutation)是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因的突变有很多类型，其中包括移码突变，缺失突变，错义突变、无义突变以及同义突变等。其中，移码突变是指在正常的DNA分子中，碱基缺失或增加非3的倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变。缺失突变是指缺失突变是编码某种氨基酸地密码子经碱基缺失以后，变成编码另一种氨基酸地密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。缺失突变的结果通常能使多肽错误，丧失原有生理功能，不能组成所需蛋白质。错义突变是指编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变，错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有功能，造成蛋白质的异常。无义突变是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，...
【技术保护点】
1.一种基于突变-编码文库的高通量筛选方法，包括如下步骤：/n(1)将目的的人全长基因编码区克隆到载体pENTR载体上，采用安捷伦公司二QuikChange II特异性位点突变试剂盒针对特定突变位点进行定点突变，获得含有人全长基因突变的载体；将特异性条形码克隆到逆转录载体上，获得含有特异性条形码的载体；将所得含有人全长基因突变的载体和所得含有特异性条形码的载体通过LR反应进行重组，构建出一系列重组载体；/n(2)将所得一系列重组载体等比例混合，转导入宿主细胞中，经过抗性筛选处理，得到含有突变基因的混合细胞文库；/n(3)对所得含有突变基因的混合细胞进行生长以及抗药性实验，之...
【技术特征摘要】
1.一种基于突变-编码文库的高通量筛选方法，包括如下步骤：
(1)将目的的人全长基因编码区克隆到载体pENTR载体上，采用安捷伦公司二QuikChangeII特异性位点突变试剂盒针对特定突变位点进行定点突变，获得含有人全长基因突变的载体；将特异性条形码克隆到逆转录载体上，获得含有特异性条形码的载体；将所得含有人全长基因突变的载体和所得含有特异性条形码的载体通过LR反应进行重组，构建出一系列重组载体；
(2)将所得一系列重组载体等比例混合，转导入宿主细胞中，经过抗性筛选处理，得到含有突变基因的混合细胞文库；
(3)对所得含有突变基因的混合细胞进行生长以及抗药性实验，之后提取基因组，并进行PCR纯化处理，然后对所得纯化产物进行测序处理。
2.根据权利要求1所述的基于突变-编码文库的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中人全长基因编码区或突变区包括PIK3CA、PIK3R1基因野生型和突变型。
3.根据权利要求1所述的基于突变-编码文库的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中特异性条形码序列为大小为30-bp随机单链DNA引物经退火处理后的寡核苷酸，用T4连接酶插入到pDONR质粒中，构成pDONR-barcode质粒载体。
4.根据权利要求1所述的基于突变-编码文库的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中LR反应过程和反应条件如下：采用Lifetechnologies的LRClonase酶，对含有PIK3CA和PIK3R1突变的pENTR载体和pDONR-barcode载体进行DNA重组反应，从而取得带有目的基因突变的pMSCV-mut-barcode载体。
5.根据权利要求1所述的基于突变-编码文库的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中重组载体pMSCV-mut-barcode转导入宿主细胞中的方法为：利用逆转录包装的gag-pol与VSCG质粒，和pMSCV-mut-barcode一起倒入HEK293T细胞进行病毒包装，两天后收取病毒。
6.根据权利要求1所述的基于突变-编码文库的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中抗性筛选处理方法和条件为：目的细胞在用低感染复数导入了混合病毒之后采用浓度为2μg/ml的嘌呤霉素筛选五天，得到混合细胞。
7.根据权利要求1所述的基于突变-编码文库的高通量筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中混合细胞生长方法为：生长实验的周期为14天，细胞培养采用正常培养条件；分别保留一份第1天的细胞，以及第14天的细胞分别抽取基因组进行后续检测。...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡欣，邵志敏，陈力，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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