本发明专利技术公开了继发性肺结核患者调节性T细胞频率的检测方法。本发明专利技术公开的方法包括：利用引物对与探针对含有FOXP3 TSDR DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，M为不同FOXP3 TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；将625‑1000个调节性T细胞混于(0.5‑10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用引物对与探针对混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据M确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3TSDR拷贝数，根据FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定待测对象调节性T细胞频率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中继发性肺结核患者调节性T细胞频率的检测方法。
技术介绍
结核病是慢性传染性疾病，据世界卫生组织评估，目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病人数的14％，位居全球第二位，我国已成为全球22个结核病高负担国家之一。结核病免疫机制主要依赖细胞免疫，结核分枝杆菌感染后，是巨噬细胞分泌大量的细胞因子，同时T淋巴细胞与巨噬细胞相互作用和协调，T淋巴细胞识别特异性抗原受体，分化参与结核结节的形成等迟发型超敏反应。研究发现抗结核整体的免疫网络需要一种调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，这种T细胞特异性分子标记是一种转录因子Foxp3(forkhead box P3 protein)，又称叉头状/翅膀状螺旋转录因子，Shohei Hori和Ohkura等已证实Foxp3在调节性T细胞在免疫应答中起关键作用(细胞谱系的形成)。调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg)是针对自身和外来抗原下调抗原特异性T细胞应答，抑制免疫病理损伤CD4+T细胞亚群。目前在实验小鼠中,基于细胞表面抗原,已经被分离、鉴定出来的最重要的一类调节性T细胞,是CD4+CD25+T细胞亚群。机体内自然生成的CD4+CD25+调节性T细胞,在胸腺中发育、成熟为具有特定功能的T细胞群,并表达叉状头/翼状螺旋转录因子(forhead-winged helix transcription factor,Foxp3).Foxp3在调节性T细胞的发生发展及免疫调节功能中有关键性的作用。调节性T细胞是免疫系统的重要成分,尤其在自身免疫性疾病中发挥重要作用,掌握调节性T细胞的作用机制具有相当重要的意义。Foxp3基因组位置Xp11.23，NCBI基因ID:50943，NC_000023.11(49250436..49265738,complement)由12外显子构成。外显子-2b和-1被5000bp分割，这个片段存在几个顺式作用元件。依据Foxp3的启动子和基因内在增强子区域的后天修饰可以区分Tconv细胞(conventional T cell，普通T细胞)和Treg细胞，Treg的基因内在增强子区域被称为(Treg-specific demethylatedregion,TSDR)，TSDR的调节顺式作用原件出现在非编码外显子-2b和-1之间被称为基因内在增强子，主要作用是调节Foxp3表达，在其+4201至+4500bp范围存在CpG残基，Tconv细胞表现为完全的甲基化，而Treg表现为完全的去甲基化。TSDR的-2786至-5558bp间存在CpG岛上游增强子，天然外周CD4+CD25-T、活化的CD4+T细胞和分泌TGF-β的Foxp3+Treg细胞表现为甲基化，而Treg表现为去甲基化。TSDR这些基因片段是Treg和其他表达Foxp3的T细胞辨别标志物。常规评价细胞功能依靠细胞培养及流式细胞检测技术，
方法繁琐，技术要求高，一般医院均无法完成。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测调节性T细胞频率。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了调节性T细胞频率的检测方法，所述方法包括：通过荧光定量PCR确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3 TSDR拷贝数，根据所述FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定所述待测对象调节性T细胞频率；所述通过荧光定量PCR确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系包括：a1)利用引物对与探针对含有FOXP3 TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3 TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；a2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种构建检测调节性T细胞频率模型的方法，所述方法包括：b1)利用引物对与探针对含有FOXP3 TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3 TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；b2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。上述方法中，所述调节性T细胞可为CD4+CD25+T细胞。上述方法中，所述625-1000个调节性T细胞可为1250-5000个调节性T细胞。所述1250-5000个调节性T细胞具体可为2500个调节性T细胞。上述方法中，所述(0.5-10)×106个单个核细胞具体可为2×106个单个核细胞。上述方法中，所述引物对可由序列表中序列1与序列2所示的单链DNA组成。所述探针的序列可为序列表中序列3。上述方法中，所述标准质粒可为将FOXP3 TSDR或其DNA片段导入克隆质粒中得到的重组质粒。上述方法中，所述克隆质粒可为pCR2.1-TOPO TA载体。上述方法中，所述FOXP3 TSDR DNA片段可为以调节性T细胞的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测调节性T细胞频率的成套试剂，所述成套试剂包括所述引物对与所述探针。上述成套试剂可由所述引物对、所述探针与克隆质粒组成。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述方法在检测或辅助检测继发性肺结核患者调节性T细胞频率中的应用。本专利技术中，所述调节性T细胞频率是指CD4+T细胞中调节性T细胞的百分比。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述成套试剂在检测或辅助检测继发性肺结核患者调节性T细胞频率中的应用。本专利技术的专利技术人通过调整粒细胞的数目，使整体的检测数据刚好处于技术检测限范围内，结果质量得到保证。实验证明，专利技术人通过调节性T细胞频率的检测方法分析继发性肺结核患者与非继发性肺结核患者抗酸染色及其对应的FOXP3 TSDR结果，发现调节性T细胞的数量与抗酸染色结果有关。继发性肺结核患者组的调节性T细胞频率为1.05％±0.43％，非继发性肺结核患者组的调节性T细胞频率为1.63％±0.70％，继发性肺结核患者组与非继发性肺结核患者组的调节性T细胞频率差异有统计学意义(Ρ＜0.05)。表明，本专利技术的调节性T细胞频率的检测方法可以用来检测继发性肺结核患者的调节性T细胞频率。附图说明图1为质粒标准品的荧光定量PCR的曲线。其中，1和2表示FOXP3 TSDR拷贝数为20000，3和4表示FOXP3 TSDR拷贝数为2000，5和6表示FOXP3 TSDR拷贝数为200，7和8表示FOXP3 TSDR拷贝数为20，9和10分别表示CUT-OFF值和稀释10倍的CUTOFF，11表示FOXP3 TSDR拷贝数为痰涂片阳性病人，实验中为阳性对照，12表示反应基线。具体实施方式下面结合具体实本文档来自技高网...
【技术保护点】
调节性T细胞频率的检测方法，包括：通过荧光定量PCR确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3TSDR拷贝数，根据所述FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定所述待测对象调节性T细胞频率；所述通过荧光定量PCR确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系包括：a1)利用引物对与探针对含有FOXP3TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；a2)将625‑1000个调节性T细胞混于(0.5‑10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。
【技术特征摘要】
1.调节性T细胞频率的检测方法，包括：通过荧光定量PCR确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3TSDR拷贝数，根据所述FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定所述待测对象调节性T细胞频率；所述通过荧光定量PCR确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系包括：a1)利用引物对与探针对含有FOXP3TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；a2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。2.一种构建检测调节性T细胞频率模型的方法，包括：b1)利用引物对与探针对含有FOXP3TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；b2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：武学成，唐曙明，冀红霞，王佃鹏，
申请(专利权)人：深圳市龙华新区慢性病防治中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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