一种校正EGFR基因突变频率的定值引物和探针组制造技术

本发明专利技术公开了一种校正EGFR基因突变频率的定值引物和探针组，具体涉及EGFR基因4个突变位点的数字PCR探针体系，通过实验优化，达到了正确分型和良好的线性表现，通过参照质控品，成功的对基因频率的定值进行有效的评估并计算得到校正系数，实现对定值实验体系的校正。

【技术实现步骤摘要】
一种校正EGFR基因突变频率的定值引物和探针组
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及到一种校正EGFR基因突变频率的定值引物和探针组以及方法。
技术介绍
EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR的过表达和肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。在非小细胞肺腺癌(NSCLC)里，EGFR基因的突变频率非常高，是非小细胞肺癌的热点突变基因，尤其是亚裔非吸烟的女性患者。针对EGFR基因的突变位点和相对应的靶向药物也研究的比较清楚。EGFR基因的常见突变位点发生在18、19、20和21号外显子上，其中19号外显子和21号外显子的突变最常见，占整个突变的90％左右，19号外显子的非移码缺失突变约占45％，21号外显子的L858R点突变占40-45％，这两种突变被称为常见突变。以EGFR基因为代表性靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂TKI是近年来NSCLC靶向治疗研究的热点之一，多项研究证实，EGFR基因突变是EGFR-TKI治疗疗效的决定性因素。研究还表明，TKI的疗效不仅与是否有EGFR基因突变相关，还与基因突变的量有密切关系。此外，EGFR基因外显子20的T790M体细胞突变是EGFR-TKI继发耐药的主要机制之一，突变使得非小细胞肺癌患者对吉非替尼和厄罗替尼出现继发耐药。因此，选择合适的检测方法筛选出靶向治疗受益人群具有重要的临床意义，尤其在肺癌患者中检测EGFR基因突变对靶向药物的筛选具有非常重要的指导意义。目前，检测EGFR基因突变的方法主要有基于测序技术的Sanger测序法和高通量测序法(NextGenerationSequencing，NGS)，和基于PCR技术的ARMS-PCR(amplification-refractorymutationsystem，ARMS)、突变富集PCR和COLD-PCR。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。如一代测序方法(Sanger测序)在应用于测定等位基因突变时所能测定的灵敏度20％左右；而高通量测序方法的灵敏度则在2-6％左右。临床实验室常用ARMS-PCR法来检测血浆游离肿瘤DNAT790M的突变，其具有操作方便、费时少等优势，然而其灵敏度仍有待提高，在1％左右。例如当血液样本中EGFR耐药位点T790M突变的丰度比较低时，会造成了一定的假阴性，使得一部分患者EGFR基因耐药突变被漏检。数字PCR是近年来一种新兴的液态活检方法，与ARMS-PCR相比理论上具有更高的精度、重复性和敏感性，且可绝对定量，灵敏度可以达到0.01％，开始逐渐替代ARMS-PCR。数字PCR方法在无创肿瘤循环DNA检测中占有重要地位，发挥了仪器检测灵敏度和分型准确的优势。然而，由于不同方法的分析灵敏度不同，会导致检测结果的不一致和不可比，且不同企业产品和实验体系在核酸定值结果上存在较大不同，主要原因可能是探针结合效率、探针荧光信号稳定性、引物与探针相互干扰等因素造成。突变频率定值在体外诊断产品中具有重要意义，作为核酸定值的公认方法，如何做到正确地评价实验体系的优劣，目前没有合适的方法体系。急需具有准确突变比例的EGFR定量标准品或定值方法等标准化方法来检验各种分析方法的灵敏度和特异性，以及各种方法之间的可比性。
技术实现思路
数字PCR仪作为核酸计量的参考方法，在基因突变频率的定值上发挥着重要用途。然而，不同的数字PCR仪和试剂在检测EGFR基因突变频率时存在显著的差异，本专利技术设计了一种实验计算方法，可以正确地评价仪器和试剂并计算突变频率。在本专利技术中，校正EGFR基因突变频率的定值方法不涉及疾病的诊断，可判断数字PCR实验体系的准确性，因此本专利技术的方法属于非诊断方法。本专利技术的目的是提供一种EGFR基因突变频率的定值实验体系及方法，该方法依托于数字PCR进行检测，充分发挥了数字PCR检测灵敏度和分型准确的优势。所述定值实验体系及方法区别于以往的EGFR基因突变检测，具有量值的可靠性。该实验体系设计了一套探针和引物组合，并引入了不同位点之间的校正系数，使得不同探针在核酸定量中得到较好的一致性。具体的，本专利技术涉及一种校正EGFR基因突变频率的定值方法，包括以下步骤：1)分别制备检测EGFR基因突变型和野生型的引物和探针，以及检测参照基因的引物和探针；3)使用上述引物和探针进行数字PCR，获得EGFR基因突变型、EGFR基因野生型以及参照基因的拷贝数；4)计算定量拷贝数校正系数n，使用所述校正系数n对突变频率进行校正。具体的，所述检测EGFR基因突变型引物探针，选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物和探针中的一种或多种。所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物具体序列可以是：EGFR-G719SFCTTACACCCAGTGGAGAAGCSEQIDNo.1EGFR-G719SRTGCCAGGGACCTTACCTTATSEQIDNo.2EGFR-Ex19delFTCTGTCATAGGGACTCTGGATSEQIDNo.3EGFR-Ex19delRAGCAAAGCAGAAACTCACATCSEQIDNo.4EGFR-T790MFCATCTGCCTCACCTCCACCSEQIDNo.5EGFR-T790MRAGCAGGTACTGGGAGCCAATSEQIDNo.6EGFR-L858RFAGCCAGGAACGTACTGGTGASEQIDNo.7EGFR-L858RRTGCCTCCTTCTGCATGGTATSEQIDNo.8。所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的野生型和突变型探针分别使用不同的荧光标记，例如野生型探针均使用VIC，突变型探针使用FAM。具体的，所述检测EGFR突变位点的野生型和突变型探针可以是：EGFR-G719SWTVIC-ATCAAAGTGCTGGGCTC-MGB-NFQSEQIDNo.13EGFR-G719SMUFAM-ATCAAAGTGCTGAGCTC-MGB-NFQSEQIDNo.14EGFR-Ex19delWTVIC-TCAAGGAATTAAGAGAAGC-MGB-NFQSEQIDNo.15EGFR-Ex19delMUFAM-TCGCTATCAAGACATCT-MGB-NFQSEQIDNo.16EGFR-T790MWTVIC-ATGAGCTGCGTGATGAG-MGB-NFQSEQIDNo.17EGFR-T790MMUFAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQSEQIDNo.18EGFR-L858RWTVIC-AGTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQSEQIDNo.19EGFR-L858RMUFAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQSEQIDNo.20。具体的，所述检测参照基因为DCK和/或EIF5B中的一种或两种，例如所述检测DCK和/或EIF5B的引物可以是：DCK-Ex3FATGCCTGTCTCAGTCGAATAAGSEQIDNo.9DCK-Ex3RGCCACGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EGFR基因突变频率的定值引物组，其特征在于，所述定值引物组包括检测EGFR基因突变型和野生型的引物对，以及检测参照基因的引物对。

【技术特征摘要】
1.一种EGFR基因突变频率的定值引物组，其特征在于，所述定值引物组包括检测EGFR基因突变型和野生型的引物对，以及检测参照基因的引物对。2.根据权利要求1的定值引物组，其特征在于，所述检测参照基因的引物对选自能够扩增DCK和/或EIF5B的引物对。3.根据权利要求1或2的定值引物组，其特征在于，所述检测DCK和/或EIF5B的引物分别为：DCK-Ex3FATGCCTGTCTCAGTCGAATAAGSEQIDNo.9DCK-Ex3RGCCACGTACAAGCCATTTATACSEQIDNo.10EIF5B-Ex1FGCTGAGCGGAGACCAAAGTSEQIDNo.11EIF5B-Ex1RTCTACCTGTCTTCGCTCTTGTTSEQIDNo.12。4.根据权利要求1的定值引物组，其特征在于，所述检测EGFR基因突变型引物对选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物对的一种或多种。5.根据权利要求1或4的定值引物组，其特征在于，具体的，所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的引物对分别为：EGFR-G719SFCTTACACCCAGTGGAGAAGCSEQIDNo.1EGFR-G719SRTGCCAGGGACCTTACCTTATSEQIDNo.2EGFR-Ex19delFTCTGTCATAGGGACTCTGGATSEQIDNo.3EGFR-Ex19delRAGCAAAGCAGAAACTCACATCSEQIDNo.4EGFR-T790MFCATCTGCCTCACCTCCACCSEQIDNo.5EGFR-T790MRAGCAGGTACTGGGAGCCAATSEQIDNo.6EGFR-L858RFAGCCAGGAACGTACTGGTGASEQIDNo.7EGFR-L858RRTGCCTCCTTCTGCATGGTATSEQIDNo.8。6.一种EGFR基因突变频率的定值探针组，所述定值探针组包括检测EGFR基因突变型和野生型的探针，以及检测参照基因的探针。7.根据权利要求6的定值探针组，其特征在于，所述检测参照基因的探针选自能够检测DCK和/或EIF5B的探针。8.根据权利要求6或7的定值探针组，其特征在于，所述检测DCK和/或EIF5B的探针分别为：DCK-Ex3FAM-CTCAGCTTGCCTCTC-MGBNFQSEQIDNo.21EIF5B-Ex1FAM-CGGGAGACAGTGGGT-MGB-NFQSEQIDNo.22。9.根据权利要求6的定值探针组，其特征在于，所述检测EGFR基因突变型探针选自检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的探针的一种或多种。10.根据权利要求9的定值探针组，其特征在于，所述检测EGFR突变位点G719S、Ex19del、T790M和L858R的野...

【专利技术属性】
技术研发人员：李达，王会如，王军，杨忠，
申请(专利权)人：北京市医疗器械检验所，
类型：发明
国别省市：北京,11