一种KRAS基因突变位点的检测引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种KRAS基因突变位点的检测引物、探针和试剂盒，目前KRAS基因的突变检测位点为KRAS基因2号外显子第12和第13位密码子上的7个热点突变点：G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V、G13D，这7种突变占到了所有突变的98.5％以上。市面上的KRAS基因突变位点检测试剂盒均采用分7管检测KRAS的7个热点突变点，检测过程繁琐，成本贵，且检测样本类型主要针对组织或血液样本，不能检测粪便这种抑制剂含量很多的样本。本发明专利技术将检测7个突变点时需要的7个反应管，减少为2个反应管，操作步骤简单，成本更低，耗时更少。并通过巧妙的引物设计进一步提高了检测的灵敏性和特异性，本发明专利技术能检出10ng的样本DNA中低至1％的突变，适宜临床实际应用和推广。

【技术实现步骤摘要】
一种KRAS基因突变位点的检测引物、探针和试剂盒
本专利技术涉及肿瘤基因突变检测领域，具体涉及一种用于检测KRAS基因突变位点的检测引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
结直肠癌和肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)占所有肺癌患者中的80％-85％，大多数肺癌患者在确诊时已处于晚期阶段。结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，又称大肠癌。正常的结直肠每天都会有数以万计的上皮细胞脱落到肠道里，如果我们的肠道内有癌或者癌前病变组织，那么这些病变组织的一部分异常细胞也会与正常细胞一起脱落，并随粪便排出体外。目前，基于癌基因的个体化快速诊断和靶向治疗的发展改变了结直肠癌和肺癌的患者的诊断和治疗模式，众所周知KRAS基因是NSCLC和结直肠癌中最常见的突变致癌基因之一，KRAS基因在1984年NSCLC基因中首次被描述，属于RAS基因家族，RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上，其中KRAS基因对人类癌症影响最大，KRAS基因正常时能控制调控细胞生长的路径；当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。因此，Kras基因突变状态与预测肿瘤患者应用靶向药物的有效性以及更好的进行个体化治疗中起着重要作用，检测组织或血浆中Kras基因突变对于指导结直肠癌、非小细胞肺癌等癌症患者临床用药，具有重要的参考价值。然而，KRAS基因突变为体细胞突变，检测方法也不同于一般性遗传突变检测。所以对检测方法的要求主要有两点:一方面由于样本模板中的突变比例未知，可能突变含量只有1％甚至更低，所以需要高灵敏度的检测方法来检出这些稀有细胞；另一方面由于样本中可能绝大多数是野生型，所以要在绝大多数野生型背景中准确检出突变细胞就需要较高的特异性。目前，市面上的KRAS基因突变位点检测试剂盒均采用分7管检测KRAS基因的7个热点突变点，检测过程繁琐，耗时长，成本贵，灵敏度和特异性不高，且检测样本类型主要针对组织或血液样本，不能检测粪便这种抑制剂含量很多的样本。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术的一个目的在于提供一种高特异性，高灵敏性，成本低，操作简单，样本适用类型广，能够同时检测7种常见KRAS基因突变的引物和探针组合物，所述KRAS基因突变包括在2号外显子第12和第13位的如下密码子突变点中的一种或多种：G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V、G13D；所述引物是将所述突变点设计在引物序列3'端的第一位，并在3'端的第二位、第三位和/或第四位增加一个或多个碱基的错配，使野生型的序列不能与设计的引物序列结合，而突变型的序列能高效的扩增。优选地，所述的密码子突变对应的碱基突变依次为34G>A、34G>C、34G>T、35G>A、35G>C、35G>T、38G>A。优选地，所述的引物包括下述上下游引物中的一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.1所示；针对KRAS基因突变点G12R检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.2所示；针对KRAS基因突变点G12C检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.3所示；针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.4所示；针对KRAS基因突变点G12D检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.6所示；针对KRAS基因突变点G12A检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.7所示；针对KRAS基因突变点G12V检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.8所示；针对KRAS基因突变点G13D检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.9所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.5所示。优选地，所述探针包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的探针序列如SEQIDNO.10所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的探针序列如SEQIDNO.11所示。优选地，所述引物和探针组合物还包括内参基因GAPDH的上、下游引物和探针，所述GAPDH的上游引物序列如SEQIDNO.12所示，所述GAPDH的下游引物序列如SEQIDNO.13所示，所述GAPDH的探针序列如SEQIDNO.14所示。本专利技术的另一目的在于提供上述引物和探针组合物在制备检测KRAS基因突变的试剂盒中的应用。优选地，所述KRAS基因突变为肿瘤样本的KRAS基因突变，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌，所述样本包括粪便样本、人类的全血样本、血浆样本、组织样本、口腔样本、尿液样本、唾液样本、FFPE样本。本专利技术的另一目的在于提供一种KRAS基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测探针组、上游检测引物组、下游检测引物组、内参基因上游引物、内参基因下游引物、内参基因检测探针，所述检测探针组中的检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，所述内参基因检测探针的5’端修饰有第二荧光报告基团；优选地，所述检测探针组中的检测探针的3’修饰有第一荧光淬灭基团，所述内参基因检测探针的3’修饰有第二荧光淬灭基团；所述上游检测引物组包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.1所示；针对KRAS基因突变点G12R检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.2所示；针对KRAS基因突变点G12C检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.3所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.5所示。所述下游检测引物组包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.4所示；针对KRAS基因突变点G12D检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.5所示；针对KRAS基因突变点G12A检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.7所示；针对KRAS基因突变点G12V检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.8所示；针对KRAS基因突变点G13D检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.9所示；所述检测探针组包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的探针序列如SEQIDNO.10所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的探针序列如SEQIDNO.11所示。优选地，所述内参基因为GADPH，所述内参基因上游引物序列如SEQIDNO.12所示，所述内参基因下游引物序列如SEQIDNO.13所示，所述内参基因检测探针序列如SEQIDNO.14所示。优选地，所述试剂盒为荧光定量PCR(QPCR)或多重荧光PCR的检测试剂盒，所述荧光报告基团为FAM、HEX、ROX或VIC，所述淬灭基团为BHQ1或TAMRA；所述第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。优选地，所述试剂盒还包括有添加剂，所述添加剂选自以下一种或几种：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够同时检测7种KRAS基因突变的引物和探针组合物，所述KRAS基因突变包括在2号外显子第12和第13位的如下密码子突变点中的任一种或多种：G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V、G13D；所述引物是将所述突变点设计在引物序列3'端的第一位，并在3'端的第二位、第三位和/或第四位增加一个或多个碱基的错配，使野生型的序列不能与设计的引物序列结合，而突变型的序列能高效的扩增；优选地，所述的密码子突变对应的碱基突变依次为34G>A、34G>C、34G>T、35G>A、35G>C、35G>T、38G>A。

【技术特征摘要】
1.一种能够同时检测7种KRAS基因突变的引物和探针组合物，所述KRAS基因突变包括在2号外显子第12和第13位的如下密码子突变点中的任一种或多种：G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V、G13D；所述引物是将所述突变点设计在引物序列3'端的第一位，并在3'端的第二位、第三位和/或第四位增加一个或多个碱基的错配，使野生型的序列不能与设计的引物序列结合，而突变型的序列能高效的扩增；优选地，所述的密码子突变对应的碱基突变依次为34G>A、34G>C、34G>T、35G>A、35G>C、35G>T、38G>A。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，所述的引物包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.1所示；针对KRAS基因突变点G12R检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.2所示；针对KRAS基因突变点G12C检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.3所示；针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.4所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.5所示；针对KRAS基因突变点G12D检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.6所示；针对KRAS基因突变点G12A检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.7所示；针对KRAS基因突变点G12V检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.8所示；针对KRAS基因突变点G13D检测设计的下游引物序列如SEQIDNO.9所示；所述探针包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的探针序列如SEQIDNO.10所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的探针序列如SEQIDNO.11所示。3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物还包括内参基因GAPDH的上、下游引物和探针，所述GAPDH的上游引物序列如SEQIDNO.12所示，所述GAPDH的下游引物序列如SEQIDNO.13所示，所述GAPDH的探针序列如SEQIDNO.14所示。4.权利要求1-3任一项所述的引物和探针组合物在制备检测KRAS基因突变的试剂盒中的应用，所述KRAS基因突变为肿瘤样本的KRAS基因突变，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌，所述样本包括粪便样本、人类的全血样本、血浆样本、组织样本、口腔样本、尿液样本、唾液样本、FFPE样本；作为优选地，所述肿瘤为结直肠癌；作为优选地，所述样本为粪便样本。5.一种KRAS基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测探针组、上游检测引物组、下游检测引物组、内参基因上游引物、内参基因下游引物、内参基因检测探针，所述检测探针组中的检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，所述内参基因检测探针的5’端修饰有第二荧光报告基团；优选地，所述检测探针组中的检测探针的3’修饰有第一荧光淬灭基团，所述内参基因检测探针的3’修饰有第二荧光淬灭基团；所述上游检测引物组包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.1所示；针对KRAS基因突变点G12R检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.2所示；针对KRAS基因突变点G12C检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.3所示；针对KRAS基因突变点G12D、G12A、G12V、G13D检测设计的上游引物序列如SEQIDNO.5所示；所述下游检测引物组包括如下任一种或多种：针对KRAS基因突变点G12S、G12R、G12C检测设计的下游引物序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹曼曼，秦闯华，徐根明，潘艺，赵谦，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43