【技术实现步骤摘要】
一种痕量核酸文库构建方法
[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种痕量单链核酸文库构建方法。
技术介绍
[0002]核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。在天然存在的核酸中核糖核酸(RNA)多以单链形式和发夹形式存在，也发现少量以环状形式存在。脱氧核糖核酸(DNA)则以双螺旋的双链形式存在为主，也有部分以单链形式存在。在生物技术诸如核酸检测、体外诊断、基因测序等领域中，对核酸的各种处理过程中也会产生单链形式的核酸。比如，自然界中存在以单链DNA或单链RNA为遗传物质的生物如人类输血传染病毒(TTV)和微小病毒等等。对这些生物的遗传物质的测序研究使用传统的NGS文库构建方法不容易实现。在法医领域，从腐烂的各种人源材料如骨骼、指甲、毛发等中提取出的DNA或RNA往往已经高度降解成了单链碎片化核酸，并且已经是痕量(如pg或者fg级别)。对这些痕量的碎片化核酸目前还没有一个高效的文库制备手段。此外，在进行DNA甲基化检测中也会涉及到将DNA进行重盐转换的步骤，重盐转换后的DNA绝大部分变成了比较短的碎片化单链DNA。对这些单链核酸的处理目前也缺少一个特别高效的技术。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提供一种可以对痕量核酸(DNA或RNA)进行文库制备的方法。该方法不依赖于DNA的双链结构。该方法文库制备效率高，广泛适用于各种长度的痕量单链或双链DNA及RNA。
[0004]本专利技术的目...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种痕量核酸文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取碎片化的，且经过5
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端磷酸化和3
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端羟基化处理的DNA单链或者cDNA；(2)步骤(1)得到的DNA片段进行3
’
端辅助连接，延伸成DNA双链；(3)步骤(2)得到的DNA双链的5
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端连接上接头，然后进行双模板底物扩增获得文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中得到的DNA片段长度10bp
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1000bp；优选50bp
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800bp，进一步优选100bp
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300bp。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的过程采用以下任一种方式：1)A、DNA片段进行3
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端辅助连接使用两种人工合成的核苷酸片段：辅助子和连接子连接：连接子与DNA的3
’
端加尾序列连接，辅助子的3
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端序列与DNA的3
’
端的加尾序列互补，辅助子5
’
端和连接子互补；辅助子和连接子的3
’
端需要进行封闭，以防止体系中的加尾酶对辅助子或连接子进行3
’
端加尾；连接子连接上去后体系中加入延伸引物，延伸引物通过退火与辅助子进行位置竞争；成功竞争到位置的延伸引物在聚合酶作用下进行DNA双链的延伸；B、在方式A基础上，使用辅助子5
’
端比长连接子3
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端短至少5个碱基的短辅助子进行辅助连接，然后使用与连接子3
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方向互补的延伸引物进行DNA片段的互补链聚合；聚合酶需要具有链置换活性或者5
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到3
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方向外切活性去除连接的辅助子；C、在方式A基础上，辅助子中含有至少1个特殊修饰碱基或碱基类似物，包括：RNA碱基、脱氧次黄嘌呤或无碱基位点；连接子连接反应完成后使用RnaseH、或Endonuclease IV修复DNA损伤的无碱基位点酶进行酶切，使辅助子断裂并暴露出聚合酶延伸聚合的羟基；再由聚合酶进行解封闭并聚合形成DNA片段互补链；D、在方式A基础上，使用RNA辅助子替代DNA辅助子，RNA辅助子在高温或者核糖核酸酶A中降解掉，降解后不会与延伸引物进行位置竞争；RNA辅助子不需要3
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端封闭；配合能够对DNA和RNA杂合链进行DNA链连接的连接酶，优选：SplintR连接酶，然后使用延伸引物进行DNA片段的互补链聚合；2)DNA片段进行3
’
端辅助连接使用一种人工合成的核苷酸片段辅助子，以及dNTP，且dNTP是普通的dNTP和热启动dNTP的混合物，普通dNTP选用四种dNTP中的任一种、两种或者三种，热启动的dNTP为选用的普通dNTP对应剩余的三种、两种或者一种；在较低温度条件下利用所述的普通dNTP进行DNA片段的加尾反应；然后给体系一个较高的温度，使热启动的dNTP进入到激活工作的状态；再给一个相对较低的温度，使辅助子与DNA片段3
’
端加尾序列互补结合，最后由DNA聚合酶分别以辅助子和DNA片段为模板向前延伸，直至以辅助子为模板延伸出辅助子的互补链，并且以DNA片段为模板延伸出DNA片段的互补链，辅助子3
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端含有与DNA片段加尾互补的序列，且3
’
末端需要进行封闭，以防止体系中的加尾酶对辅助子进行3
’
加尾；辅助子3
’
端使用磷酸基团修饰或C3 Spacer修饰封闭，那么辅助子3
’
端设计的碱基不应与DNA链互补，通过在体系中添加高保真聚合酶或其它3
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外切活性的酶进行切除不互补碱基来进行解封闭；或者，辅助子3
’
端使用磷酸基团或C3 spacer封闭，辅助子3
’
端最后一个碱基不要求为不互补碱基，辅助子中含有至少1个特殊修饰碱基或碱基类似物，包括：RNA碱基、脱氧次黄嘌呤或无碱基位点；连接子连接反应完成后使用RnaseH、或Endonuclease IV修复DNA损伤
的无碱基位点酶进行酶切，使辅助子断裂并暴露出聚合酶可以延伸聚合的羟基；再由聚合酶进行解封闭并聚合形成DNA片段互补链。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第1)种方式中：DNA片段3
’
端辅助连接和延伸成DNA双链的过程包括：在同一反应体系中进行，或者在两个反应体系中进行；如若在同一反应体系中进行，则体系中还需要添加普通的dNTP和热启动dNTP的混合物，普通dNTP选用四种dNTP中的任一种、两种或者三种，热启动的dNTP为选用的普通dNTP对应剩余的三种、两种或者一种；在较低温度条件下利用所述的普通dNTP进行DNA片段的加尾反应；然后在辅助子的帮助下连接子连接上DNA片段，再给体系一个较高的温度，使热启动的dNTP进入到激活工作的状态；最后给一个相对较低的温度，使用辅助子，或者引物，以DNA片段为模板向前延伸，获得DNA片段的互补链；如果DNA片段3
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端辅助连接和延伸成DNA双链的过程不在同一反应体系中进行，无需使用热启动的dNTP，而采用普通的dNTP，则没有给体系一个较高的温度，使热启动的dNTP进入到激活工作的状态的过程；采用四种普通的dNTP中的一种、两种或者三种加尾，采用四种普通的dNTP进行延伸。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第1)种方式中：封闭方式为使DNA3
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端不能够进行延伸的修饰，包括：磷酸基团修饰、C3 Spacer修饰或RNA碱基修饰中的任一种。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，辅助子3
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端使用磷酸基团修饰或C3 Spacer修饰封闭，那么辅助子3
’
端设计的碱基不应与DNA链互补，通过在体系中添加高保真聚合酶或其它3
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外切活性的酶进行切除不互补碱基来进行解封闭；或者，辅助子3
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端使用磷酸基团或C3 spacer封闭，辅助子3
’
端最后一个碱基为不互补碱基，辅助子中含有至少1个特殊修饰碱基或碱基类似物，包括：RNA碱基、脱氧次黄嘌呤或无碱基位点；连接子连接反应完成后使用RnaseH、或Endonuclease IV修复DNA损伤的无碱基位点酶进行酶切，使辅助子断裂并暴露出聚合酶可以延伸聚合的羟基；再由聚合酶进行解封闭并聚合形成DNA片段互补链；RNA碱基修饰的方式为辅助子3
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端至少第1个碱基采用RNA碱基进行封闭；所述的RNA碱基为rA、rG、rC或rU，通过高温处理解除封闭。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的第1)种方式中：DNA片段进行3
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端辅助连接使用两种人工合成的核苷酸片段，辅助子和连接子与DNA作用在连接发生以前将产生三种中间产物：产物1：DNA的3
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端尾与连接子在辅助子的帮助下刚好完全互补，DNA的3
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端尾与连接子之间没有碱基缺口或冗余区，这时此产物由DNA连接酶通过形成磷酸二酯键进行连接；产物2：DNA的3
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端尾与连接子的5
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端之间有碱基缺口，需要由DNA聚合酶聚合补上缺口后再由DNA连接酶进行连接；产物3：DNA的3
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端尾与连接子的5
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端之间有碱基冗余，需要由核酸内切酶或外切酶切掉冗余碱基后再由DNA连接酶进行连接。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，DNA3
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端辅助连接通过限制辅助子与DNA3
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端尾互补的碱基数目为10个以下来减少或消除产物3的产生。9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的连接子的长度范围5
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80nt，优选10
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6...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永利，贺田芬，鞠巍，汤链，徐根明，郭杰安，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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