一种大体积尿液的预处理方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种大体积尿液的预处理方法及应用。本发明专利技术可以从大量尿液中进行高效低成本的DNA富集，并有效去除血尿中的血红素、尿素等影响后续分子生物学反应的抑制物，从而对富集产物直接进行检测，以达到更快速检测的目的。本发明专利技术的检测方法及其检测试剂盒可以从100mL尿液中精确检测5个拷贝的尿路上皮癌相关突变DNA分子。关突变DNA分子。关突变DNA分子。

【技术实现步骤摘要】
一种大体积尿液的预处理方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种大体积尿液的预处理方法及应用。属于基因检测


技术介绍

[0002]尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，是最常见的泌尿系统肿瘤。其中尿路上皮癌可分为非肌层浸润性尿路上皮癌和肌层浸润性尿路上皮癌。而10～15％的肌层浸润性尿路上皮癌患者在确诊时已出现转移。西方国家的尿路上皮癌发病率位列第4，仅次于前列腺癌、肺癌、结直肠癌。从发生部位来看，包括发生于上尿路的肾盂癌和输尿管癌以及下尿路的膀胱癌和尿道癌。其中上尿路上皮癌较少，在临床上只占尿路上皮癌的5～10％，与膀胱癌不同的是上尿路上皮癌约60％是浸润性肿瘤，预后不佳。膀胱全切或肾输尿管全长切除术是治疗尿路上皮肿瘤的金标准，但是对高危的肿瘤的患者来讲，术后局部复发或远处转移是导致长期生存没有改善的主要原因。50％的浸润型膀胱癌患者在手术前，已经存在潜在转移灶。在中国，膀胱癌是十大常见癌种之一，因易复发、易转移、治疗手段有限，已经成为我国重要疾病负担之一，并严重威胁患者的生存时间和生活质量。尿路上皮癌(UC)是常见的一种膀胱癌，占所有膀胱癌病例的90％以上。
[0003]血尿是指离心沉淀尿中每高倍镜视野≥3个红细胞，或非离心尿液超过1个或1小时尿红细胞计数超过10万，或12小时尿沉渣计数超过50万，均示尿液中红细胞异常增多，是常见的泌尿系统症状。原因有泌尿系炎症、结核、结石或肿瘤、外伤、药物等，对机体影响甚为悬殊。轻者仅镜下发现红细胞增多，称为镜下血尿；重者外观呈洗肉水样或含有血凝块，称为肉眼血尿。通常每升尿液中有1mL血液时即肉眼可见，尿呈红色或呈洗肉水样。由于临床上血尿的原因众多，因此我们往往需要快速知道血尿是否为尿路上皮癌相关，也就是对血尿患者进行尿路上皮癌的早期筛查和诊断。同时由于尿路上皮癌复发率很高，临床上也需要对尿路上皮癌患者进行复发监测。
[0004]尿路上皮癌可以导致血尿，但并不是血尿就意味着尿路上皮癌。传统的尿路上皮癌诊断方法有癌胚抗原检测、膀胱镜检等方法。癌胚抗原检测检测的准确度仍有待提高，膀胱镜检往往给病人增加痛苦和心理负担。因此使用尿液进行尿路上皮癌的无创性检测正在成为一个更好的方法。
[0005]无创性检测是指采用尿液、外周血、指甲、头发、唾液等作为检测的取样材料来进行的检测。相对于有创性检测来讲，无创性检测可以极大减小对被检测者的心理压力，也可以减小甚至避免取样造成的组织或器官损伤，以及感染等情况。
[0006]尿路上皮癌的无创性检测可以使用患者的尿液来进行。健康人的尿液当中都含有游离DNA，而对于尿路上皮癌患者，其尿液中不仅含有正常的游离DNA，也会从病灶中释放癌症特异性的DNA到尿液中。通过检测这些癌症特异性的DNA就可以对尿路上皮癌进行无创性检测。
[0007]TERT基因是端粒酶逆转录酶基因，它编码端粒酶中具有逆转录活性的催化亚基。该基因在维持端粒长度和基因组稳定性上具有重要作用。人类TERT基因核心启动子区的激
活突变会导致转录因子Ets/TCF结合能力增强，从而导致该基因转录活性增加2
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4倍。TERT基因核心启动子区突变是尿路上皮癌组织最高频的突变之一，其达到了80％以上。并且研究发现，TERT基因核心启动子区突变是与尿路上皮癌进展期无关的突变。这意味着TERT基因核心启动子区突变是可以作为尿路上皮癌早期筛查的生物标志物。
[0008]对于早期或超早期的尿路上皮癌患者，由于其病灶微小，病灶释放出来的癌症特异性DNA会非常少，甚至可能少至几个拷贝的DNA分子。成年人每天大概会产生3L左右尿液，每次尿量一般平均为400～500mL左右。这么少的DNA释放到如此大量的尿液中，这对DNA检测技术提出了相当大的挑战。目前市场上还没有一种对超大体积尿液进行高效低成本DNA提取的方案。目前的商业化尿液DNA检测方法一般为取尿液中的一小部分，如2～3mL，首先进行尿液DNA提取，然后再通过QPCR定量或者测序的方法进行检测。尿液的抽提增加了实验的复杂程度，比较耗费时间，而且最重要的是由于只取一小部分尿液进行检测，这大大降低了含有微量癌症特异性DNA的早期或超早期的尿路上皮癌患者的检测灵敏度。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种大体积尿液的预处理方法及应用。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0011]一种大体积尿液的预处理方法，具体步骤如下：
[0012](1)先利用蛋白酶K对尿液进行蛋白质消化，得到尿液Ⅰ；
[0013](2)再利用交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP去除尿液Ⅰ中的QPCR分子生物学反应抑制剂成分，得到尿液Ⅱ；
[0014](3)再以多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒对尿液Ⅱ中的游离DNA进行富集，即可得到可用于QPCR检测的尿液样本。
[0015]优选的，步骤(1)中，所述尿液为新鲜血尿或收集后迅速冷冻的血尿。
[0016]优选的，步骤(1)的具体方法为：先将血尿经冷冻离心机800g离心10分钟，取上清，然后向上清中加入蛋白酶K，55℃消化30分钟即可；其中，血尿与蛋白酶K的体积比为1000：1，蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
[0017]优选的，步骤(2)的具体方法为：先向尿液Ⅰ中加入交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP，垂直混匀仪上颠倒混匀，接着经冷冻离心机1600g离心5分钟，取上清，即为尿液Ⅱ；其中，血尿与PVPP的用量比为100mL：35mg。
[0018]优选的，步骤(3)中，多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒，其制备方法如下：先将硅胶粉、粉末状多聚赖氨酸加入pH＝7的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris
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HCl中，涡旋30分钟，离心取沉淀，清洗，即得；其中，硅胶粉、粉末状多聚赖氨酸、Tris
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HCl的配比为250mg：100mg：10mL，Tris
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HCl的浓度为100mM。
[0019]优选的，步骤(3)的具体方法为：先将多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒均匀分散于Tris
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HCl中，得到处理液，接着将处理液加入尿液Ⅱ中，垂直混匀仪上颠倒混匀30分钟，室温静置，沉淀完全后弃上清，然后将所得沉淀利用无菌去离子水悬浮起来，静置待完全沉淀后弃上清，重复无菌去离子水悬浮步骤，最后向所得沉淀中加入碳酸氢钠水溶液，80℃处理30分钟，洗脱两次即可；其中，硅胶粉、Tris
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HCl、尿液Ⅱ、无菌去离子水、碳酸氢钠水溶液的
配比为13.33mg：40μL：100μL：1mL：30μL，碳酸氢钠水溶液的浓度为100mM。
[0020]上述一种大体积尿液的预处理方法在制备尿路上皮癌突变基因QPCR检测试剂盒尿液样本中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术可以从大量尿液中进行高效低成本的DNA富集，并有效去除血尿中的血红素、尿素等影响后续分子生物学反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大体积尿液的预处理方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)先利用蛋白酶K对尿液进行蛋白质消化，得到尿液Ⅰ；(2)再利用交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP去除尿液Ⅰ中的QPCR分子生物学反应抑制剂成分，得到尿液Ⅱ；(3)再以多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒对尿液Ⅱ中的游离DNA进行富集，即可得到可用于QPCR检测的尿液样本。2.根据权利要求所述的一种大体积尿液的预处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述尿液为新鲜血尿或收集后迅速冷冻的血尿。3.根据权利要求所述的一种大体积尿液的预处理方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：先将血尿经冷冻离心机800g离心10分钟，取上清，然后向上清中加入蛋白酶K，55℃消化30分钟即可；其中，血尿与蛋白酶K的体积比为1000：1，蛋白酶K的浓度为20mg/mL。4.根据权利要求所述的一种大体积尿液的预处理方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：先向尿液Ⅰ中加入交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP，垂直混匀仪上颠倒混匀，接着经冷冻离心机1600g离心5分钟，取上清，即为尿液Ⅱ；其中，血尿与PVPP的用量比为100mL：35mg。5.根据权利要求所述的一种大体积尿液的预处理方法，其特征在于，步骤(3)中，多聚赖氨酸包被的二氧化硅颗粒，其制备方法如下：先...

【专利技术属性】
技术研发人员：王龙，徐根明，李超，王永利，姚鲲，刘建业，鞠巍，汤维，李仁君，李永祥，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：