一种RNA保护剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种RNA保护剂及其应用。该保护剂包括以下组分：离液剂、助沉剂、还原剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、低级醇、缓冲液和溶剂。其中：离液剂为异硫氰酸胍或者盐酸胍；还原剂为三(2

【技术实现步骤摘要】
一种RNA保护剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物RNA样本保存
，尤其涉及一种常温保存液态样本中RNA的组合物保护剂及其应用方法。

技术介绍

[0002]前列腺癌是男性最常见的癌症之一。患者是否患有前列腺癌主要是根据PSA，一种血液中的癌症因子。然而，由于诊断准确率低至30％，相当多的患者需要进行额外的侵入性活检，从而产生副作用，如出血和疼痛等。
[0003]作为一种非侵入性的方法，利用尿液进行诊断检测对患者来说是方便的，不需要侵入性活检，从而诊断癌症没有副作用。然而，尿液中核酸浓度低，其中前列腺来源的成分更少，尤其是前列腺特异的RNA含量不高，大多数情况下，由于各种各样的原因，RNA从生物样本中提取出来后并不能立刻得到检测。含RNA的生物样品一旦从体内采集分离，它的RNA会变得非常不稳定，极易被降解。通常需要在液氮或
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80℃条件下保存，限制了尿液RNA检测的应用，因此，开发一种能够有效防止RNA降解，不影响后续检测结果的尿液RNA保存液，对尿液RNA的分子生物学检测非常重要，对于拓展尿液样本检测应用具有重要意义。
[0004]目前针对RNA保护的产品还存在如下缺陷：1.绝大部分专利针对的样本类型为组织、血液、拭子等RNA含量较高的样本，针对尿液等RNA含量很低的体液样本的保存液稀缺。2.现有的针对尿液RNA保存的保护剂如Norgen的尿液保存管，保存尿液后需通过提取混合液获得RNA，常规提取试剂盒所提的样本单次体积在2
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5ml，且提取成本很高，亟待开发一款尿液RNA保护剂，其所保存的尿液样本可以通过低速离心的方式富集沉淀后采用常规Trizol法提取沉淀中RNA，如此可以轻松实现几十毫升尿液样本的单次提取，大大降低了提取成本。3.现有的针对尿液RNA保存的保护剂中使用的还原剂基本为β
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巯基乙醇、二硫苏糖醇DTT，此类还原剂用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但β
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巯基乙醇本身只有一个巯基，它的效果一般只能维持2－3天。因此，在实验中要每隔2－3天补加一次β
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巯基乙醇来维持它的作用，且β
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巯基乙醇具挥发性、强刺激性、毒性。二硫苏糖醇DTT有两个巯基基团，还原性较β
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巯基乙醇略强，其作用能维持3－7天，但其往往无法还原包埋于蛋白质结构内部(溶剂不可及)的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性(高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1％SDS)。且DTT容易被空气氧化，DTT的稳定性较差，需冷冻保存或在惰性气体中处理以延长它的使用寿命。因此，需要找到更稳定有效的还原剂。4.现有的针对尿液RNA保存的保护剂的研究主要验证的是总RNA含量变化和mRNA扩增差异，缺少尿液RNA片段大小分布数据和RNA
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Seq验证数据。而明确RNA片段大小范围及RNA
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Seq验证数据对RNA测序应用领域具有重要作用。
[0005]此外，临床检测时会遇到各种类型尿液样本，有特别澄清透亮脱落细胞很少的尿液样本，有出现血尿的样本，因此尿液样本的复杂性导致尿液样本RNA的保存难度增大，这在本专利技术实际探索过程中也有体现。不同样本状态下最佳离液剂、助沉剂、还原剂等的使用
量均有差异。需要经过大量样本的测试、获得能够适用于各种类型尿液样本的保护剂，综合平衡其对不同样本的保护效果，以满足临床实际应用需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的在于提供一种RNA保护剂，该保护剂可有效保持所运输、保存的液态样本，尤其是尿液样本中RNA的稳定性，更重要的是能够适用于各种类型尿液样本的保存。经本专利技术的保存液保存的尿液样本还能够通过低速离心的方式富集沉淀，然后通过常规Trizol法提取沉淀中的RNA，为下游提取提供了便捷方式，增加了原始尿液样本的提取体积，解决了尿液样本大体积提取困难的问题，极大地降低了提取难度和提取成本。本专利技术实现了大体积尿液样本的常温保存和运输问题，同时所提取的RNA能很好地适应于后续RT
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PCR和RNA
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seq应用。还通过多种方式验证了该保存液保存的RNA具有高浓度、高完整性、长时间保存后的高稳定性等优异指标。
[0007]本专利技术采用如下技术方案实现：
[0008]一种RNA保护剂，包括以下组分：离液剂、助沉剂、还原剂、核酸酶抑制剂；其中：
[0009]离液剂包括：异硫氰酸胍、盐酸胍中的至少一种；
[0010]还原剂包括：三(2
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羧乙基)膦盐酸盐；
[0011]助沉剂包括：PEG、磺基水杨酸的至少一种。
[0012]所述的RNA保护剂，离液剂在保护剂中的浓度3
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5M，优选3.5
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4.5M，进一步优选3.8
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4.2M，最优选4M。
[0013]所述的RNA保护剂，三(2
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羧乙基)膦盐酸盐在保护剂中的浓度50
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300mM，优选150
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250mM，进一步优选180
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220mM，最优选200mM。
[0014]所述的RNA保护剂，PEG在保护剂中的浓度5
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30％，优选15
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25％，进一步优选18
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22％，最优选20％；磺基水杨酸在保护剂中的浓度250mM
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1M，优选300
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800mM，进一步优选400
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600mM，最优选500mM。
[0015]所述的RNA保护剂，核酸酶抑制剂包括如下组分中的一种或多种：乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐、乙二醇四乙酸(EGTA)及其盐、金精三羧酸(ATA)、甘油醛、NaF、甲酰胺、钒基核糖核苷复合物、8
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羟基喹啉、皂土、十二烷基硫酸钠(SDS)、半胱氨酸。。EDTA在保护剂中浓度5
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100mM，优选30
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60mM，进一步优选45
‑
50mM，最优选50mM；
[0016]EGTA在保护剂中浓度5mM
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100mM，优选30
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60mM，进一步优选45
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50mM，最优选50mM；
[0017]ATA在保护剂中浓度0.5
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10mM，优选2
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8mM，进一步优选4
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6mM，最优选5mM；
[0018]甘油醛在保护剂中浓度50mM
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200mM，优选60
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150mM，进一步优选80
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120mM，最优选100mM；
[0019]NaF在保护剂中浓度1mg/ml
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10mg/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA保护剂，其特征在于，包括以下组分：离液剂、助沉剂、还原剂、核酸酶抑制剂；其中：离液剂包括：异硫氰酸胍、盐酸胍中的至少一种；还原剂包括：三(2
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羧乙基)膦盐酸盐；助沉剂包括：PEG、磺基水杨酸中的至少一种。2.根据权利要求1所述的RNA保护剂，其特征在于，离液剂在保护剂中的浓度3
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5M，优选3.5
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4.5M，进一步优选3.8
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4.2M，最优选4M。3.根据权利要求1所述的RNA保护剂，其特征在于，三(2
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羧乙基)膦盐酸盐在保护剂中的浓度50
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300mM，优选150
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250mM，进一步优选180
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220mM，最优选200mM。4.根据权利要求1所述的RNA保护剂，其特征在于，PEG在保护剂中的浓度5
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30％，优选15
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25％，进一步优选18
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22％，最优选20％；磺基水杨酸在保护剂中的浓度250mM
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1M，优选300
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800mM，进一步优选400
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600mM，最优选500mM。5.根据权利要求1所述的RNA保护剂，其特征在于，核酸酶抑制剂包括如下组分中的一种或多种：乙二胺四乙酸及其盐、乙二醇四乙酸及其盐、金精三羧酸、甘油醛、NaF、甲酰胺、钒基核糖核苷复合物、8
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羟基喹啉、皂土、十二烷基硫酸钠、半胱氨酸。6.根据权利要求5所述的RNA保护剂，其特征在于，乙二胺四乙酸及其盐在保护剂中浓度5
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100mM，优选30
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60mM，进一步优选45
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50mM，最优选50mM；乙二醇四乙酸及其盐在保护剂中浓度5mM
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100mM，优选30
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60mM，进一步优选45
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50mM，最优选50mM；金精三羧酸在保护剂中浓度0.5
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10mM，优选2
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8mM，进一步优选4
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6mM，最优选5mM；甘油醛在保护剂中浓度50mM
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200mM，优选60
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150mM，进一步优选80
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120mM，最优选100mM；NaF在保护剂中浓度1mg/ml
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10mg/ml，优选3
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6mg/ml，进一步优选4
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5mg/ml，最优选5mg/ml；甲酰胺在保护剂中浓度10mg/ml
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100mg/ml，优选30
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60mg/ml，进一步优选40
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50mg/ml，最优选50mg/ml；钒基核糖核苷复合物在保护剂中浓度10mg/ml
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100mg/ml，优选30
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60mg/ml，进一步优选40
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50mg/ml，最优选50mg/ml；8
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羟基喹啉在保护剂中浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐根明，汤链，王永利，鞠巍，冯金儒，贺田芬，刘雅静，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：