一种高通量快速检测体液宏基因组病原微生物的方法技术

一种高通量快速检测体液宏基因组病原微生物的方法，其属于生物技术领域。该方法包括体液病原微生物的提取及建库的整个流程。提取过程所用的试剂包括蛋白酶K溶液、磁珠、裂解液、裂解结合液、一次洗涤液、二次洗涤液和洗脱液，建库流程中所用的试剂包括末端修复酶、接头试剂、pcr试剂。病原微生物提取过程中，优化了细胞裂解液、裂解结合液、一次洗涤液和二次洗涤液的配方，病原微生物建库过程中优化了低样本量建库的实验方法。本发明专利技术改善了体液宏基因组微生物检测的实验方法，缩短了检测时间，为体液类样本的测序奠定实验基础。为体液类样本的测序奠定实验基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量快速检测体液宏基因组病原微生物的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及宏基因组病原微生物的提取及得到核酸提取物，并对其核酸进行文库的构建，最终进行宏基因组测序。

技术介绍

[0002]游离DNA(CirculatingfreeDNAorCellfreeDNA，cfDNA)，循环游离DNA或者细胞游离DNA，是释放到血浆中的降解的DNA片段。cfDNA存在于人体的各种体液中，随组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。正常人体的cfDNA主要通过细胞凋亡过程中产生的小而均匀的185
‑
200bp小片段DNA。在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA入血，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA(ctDNA)和来源于胎儿的cfDNA等，导致产生大小不同且大于200bp的大片段DNA。血液不是可用于液体活检的唯一体液，例如尿液、粪便、脑脊液(CSF)、唾液、胸水和腹水都是潜在来源，可从中获得某些疾病或感染的核酸物质(包括cfDNA)。
[0003]游离核酸的提取成为检测的关键步骤，传统提取使用的试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量快速检测体液宏基因组病原微生物的方法，其特征在于：从体液样本中分离提取DNA得到核酸提取物；对其核酸进行文库构建，最终进行宏基因组测序，得到所述样本相关的宏基因组测序结果；S1.样本前处理：将所得样本进行离心处理，将上清转移到离心管中；S2.细胞裂解：向S1中的离心管中加入10
‑
30ul的蛋白酶K溶液和裂解液LS Buffer，最大速度涡旋混匀；涡旋后的离心管放入恒温水浴锅中进行孵育20
‑
40min；孵育后静置10
‑
15min；所述裂解液LS Buffer中乙二胺四乙酸的浓度为10
‑
30mmol/L，氯化钠的浓度为100
‑
350mmol/L，曲拉通X
‑
100的浓度为3
‑
10％体积分数，异硫氰酸胍的浓度为1
‑
8mol/L、Tween20的浓度为5～8wt％；S3.微生物的裂解与结合：向S2的离心管中加入磁珠与裂解结合液LB Buffer,颠倒混匀，并于室温连续混匀5
‑
20min；将离心管置于磁力分离架上，室温等待至溶液变得完全澄清，磁珠完全吸附于管内一侧；保持吸附状态，小心吸除上清，吸除所有上清后，移除磁力分离架；所述裂解结合液LB Buffer中包括50
‑
300g/L的异硫氰酸胍、2
‑
8g/L的氯化钠、体积占比20％
‑
50％的曲拉通X
‑
100、体积占比5％
‑
40％的异丙醇、5
‑
15g/L的柠檬酸、10mM～50mM的三羟甲基氨基甲烷；S4.一次洗涤：加入洗涤液H1，涡旋混匀3
‑
7min；把离心管置于磁力分离架上，室温等待至磁珠完全吸附于管内一侧；保持吸附状态，吸除上清并移除磁力分离架；重复此步骤一次；所述洗涤液H1中乙二胺四乙酸的浓度为5
‑
100mmol/L，氯化钠的浓度为100
‑
300mmol/L，无水乙醇的浓度为20
‑
60％体积分数，异丙醇的浓度为25％
‑
80％体积分数，曲拉通X
‑
100的浓度为2
‑
5％体积分数；盐酸胍的浓度为3～7mol/L、Tween20的浓度为1～10wt％；S5.二次洗涤：加入洗涤液H2，涡旋混匀3
‑
7min；把离心管置于磁力分离架上，室温等待至磁珠完全吸附于管内一侧；保持吸附状态，吸除上清并移除磁力分离架；重复此步骤一次；所述二次洗涤液H2的成分为75％的乙醇；S6.干燥磁珠：把离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐君南，赵毅，孙蕾，
申请(专利权)人：辽宁康惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：