基于高通量测序的基因多位点的检测方法，其属于分子检测的技术领域。该方法主要包括样本提取、文库制备、pooling文库和文库上机；首先，使用高效快速的提取试剂盒，保证样本的DNA在最快的时间内抽提出来；第二步引入多重PCR扩增技术，为避免扩增子间的相互干扰特分别设计了2个引物pool；第三步通过计算公式实现多样本混库；最后使用CN500测序仪实现文库上机测序。该方法可实现短时间内对多个样本同时进行遗传与药物联合检测，扩增子的设计避免了相互干扰，无需打断核酸，样本起始量要求低，样本易获取（全血），特异性高，可实现遗传疾病300
【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序的基因多位点的检测方法
[0001]本专利技术涉及分子检测领域，具体地，涉及基于高通量测序的基因多位点的检测方法，主要的样本为全血。
技术介绍
[0002]截止2021年我国心血管疾病总人数高达2.9亿，心血管疾病由遗传性疾病和非遗传性疾病构成。超过4000万人因基因突变所致的心血管疾病，心血管疾病是我国死亡人数最多的疾病，占总死亡人数的43.5％，这些疾病可能长期隐匿，一旦发病，异常危险，如猝死、恶性心律失常、心衰、主动脉破裂等。每年有超过50万人因心血管疾病而导致猝死。青年人猝死率高达50％，绝大多数为常染色体显性遗传，后代遗传概率为50％，不同基因突变导致的心血管疾病临床表现可能相同或相似，传统检查对此难以区分，其中的遗传性心血管疾病是指发病由基因突变引起，可以遗传给下一代的一组心血管疾病。随着高通量测序技术的迅猛发展，测序成本逐渐降低，以基因测序为基础的精准医疗在心血管领域得到了广泛应用，可实现根据基因分型指导单基因遗传性心血管疾病的诊断和治疗，所涉及的单基因遗传性心血管疾病包括心肌病、心脏离子通道病、遗传性主动脉疾病、遗传性易栓症以及家族性高胆固醇血症等，目前大部分单基因遗传性疾病已实现了病因诊断。
[0003]目前高通量测序针对遗传性心血管疾病的检测多依赖于两条技术路线，即杂交捕获和多重PCR，其中杂交捕获是指将基因组打断为片段后，加入事先设计好的探针，把这些片段“抓”出来，从而达到富集的目的，但是杂交捕获技术流程稍显繁琐，同时具有更高的背景噪音，操作时间长，特异性在70％左右，实验操作较难不利于开展实验且成本较高；多重PCR是指在一个体系中进行多个PCR反应，PCR的引物铺设在感兴趣的DNA区域，多轮反应后，目标区域就显著富集了。多重PCR技术小、快、灵，实验周期短，但覆盖范围较小，引物间可能存在互相干扰的状况。
[0004]目前对于药物检测治疗涉及的样本类型包括干血片、全血、口腔拭子，可一次性获取所有药物基因多态性位点，但研究仅限于提供药物指导，并未与遗传检测相联系同时提供两方面信息，而对于市面上药物检测联合遗传检测多应用在肿瘤检测或者精神疾病类检测，其样本获取较难，前处理较长，且扩增子并未分Pool设计，很容易产生引物间相互干扰影响检测结果准确性，且此类检测对未来预知性差，多在疾病暴露后才参与治疗。
[0005]现有的PCR遗传疾病检测技术是利用一对引物为介导的一种在体外的海促DNA合成技术，它能在短时间内将靶DNA扩增百万倍，操作简便，省时，它可以直检突变基因，也可与其它技术结合共同检测，但是此PCR检测依赖单对引物检测，一次实验投入的引物数较少，且检测位点有限，不能同时进行遗传与药物的检测，实验中容易造成非特异性扩增影响实验结果的准确性。
技术实现思路
[0006]为解决上述覆盖范围小、引物间的干扰、检测信息单一、检测位点少准确性低等技
术问题，本专利技术提供了基于高通量测序的基因多位点的检测方法，本专利技术涉及遗传扩增子300
‑
500个，药物基因扩增子100
‑
300个，为了避免引物间干扰特分别设计两个引物池，覆盖度更广，检测位点更多。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0008]基于高通量测序的基因多位点的检测方法，包括以下步骤：
[0009](1)样本提取：
[0010]样本提取采用天根试剂盒～过柱法抽提样本DNA，所述全血体积为100～400ul；
[0011](2)文库制备：
[0012]所述文库制备采用PARAGON GENOMICS公司提供的试剂盒，遗传和药物分别设置了各自的扩增子，分别设置以避免一个类型中扩增子间的相互干扰，实验流程涉及合并遗传或药物检测引物pool；
[0013]其文库制备主要包括以下几个具体步骤：
[0014]①
多重PCR反应
[0015]多重PCR反应的样本起始投入量为10～70ng，遗传和药物检测分管操作，且遗传和药物也分别设置2
‑
5个单管；
[0016]mPCR上机退火及延伸时间为2～10min，其变性/退火、延伸的循环数为7～12cycle；在5～15℃反应时间不超过30min；
[0017]纯化前分别将遗传的2
‑
5个单管合并为遗传管，将药物的2
‑
5个单管合并为药物管，遗传管或药物管的管内包含了150～500个引物扩增的产物；
[0018]②
Post～mPCR纯化
[0019]分别向遗传管或药物管中加入1.1～1.8x磁珠，纯化扩增后产物；纯化后弃掉上清，乙醇洗涤；添加Tris
‑
EDTA Buffer回收样本，获得带磁珠的文库；
[0020]③
消化反应
[0021]带磁珠的文库加消化buffer和酶mix进行消化，消化buffer与酶mix的体积比为1:1，上机程序为30
‑
40℃下孵育5
‑
15min，得到孵育消化后的文库；
[0022]④
消化后纯化
[0023]向孵育消化后的文库中添加终止缓冲液后，添加1.1～1.8x磁珠进行纯化；纯化完成后使用Tris
‑
EDTA Buffer回收磁珠DNA；
[0024]⑤
Post～Second PC
[0025]其上机PCR扩增的循环数为7～15cycle；
[0026]⑥
Post～Second PCR纯化；
[0027]该步骤采用磁珠的纯化体系为0.5～1.5x，获得的文库，并分别测量遗传管与药物管文库浓度；
[0028](3)Pooling文库：
[0029]根据混库的计算公式分别计算出遗传管和药物管的取样体积，其根据计算公式如下:
[0030]遗传管或药物管取样体积＝单个样本预期产生数据量*片段长度/(文库浓度*1515)，其中：单样本预期产出数据量＝芯片总数据量/样本个数，片段长度为200～350bp，文库浓度即为文库制备后遗传管或药物管的文库浓度；再将总文库浓度ng/ul转化为nM，其
转化公式为：浓度*106/660/片段长度；
[0031]此时的浓度为多样本混合后测得的Qubit(ng/ul)浓度然后将ng/ul转化为nM，其转化公式为nM＝浓度*106/660/片段长度；(4)文库上机：
[0032]文库上机采用illumina试剂盒，采用中通量芯片上机测序，上机平台是CN500平台；
[0033]变性文库的NaOH稀释至0.1～0.5N；上机前的文库需要进行热孵育，其孵育温度为80～100℃；上机的文库终浓度为1.0
‑
3.8pM。
[0034]所述(1)的方法，其中样本提取处取完全血后向管内加入100～300μl缓冲液GB和10～30μl Proteinase K，充本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.基于高通量测序的基因多位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样本提取：样本提取采用天根试剂盒～过柱法抽提样本DNA，所述全血体积为100～400ul；(2)文库制备：所述文库制备采用PARAGON GENOMICS公司提供的试剂盒，遗传和药物分别设置了各自的扩增子，分别设置以避免一个类型中扩增子间的相互干扰，实验流程涉及合并遗传或药物检测引物pool；其文库制备主要包括以下几个具体步骤：
①
多重PCR反应多重PCR反应的样本起始投入量为10～70ng，遗传和药物检测分管操作，且遗传和药物也分别设置2
‑
5个单管；mPCR上机退火及延伸时间为2～10min，其变性/退火、延伸的循环数为7～12cycle；在5～15℃反应时间不超过30min；纯化前分别将遗传的2
‑
5个单管合并为遗传管，将药物的2
‑
5个单管合并为药物管，遗传管或药物管的管内包含了150～500个引物扩增的产物；
②
Post～mPCR纯化分别向遗传管或药物管中加入1.1～1.8x磁珠，纯化扩增后产物；纯化后弃掉上清，乙醇洗涤；添加Tris
‑
EDTA Buffer回收样本，获得带磁珠的文库；
③
消化反应带磁珠的文库加消化buffer和酶mix进行消化，消化buffer与酶mix的体积比为1:1，上机程序为30
‑
40℃下孵育5
‑
15min，得到孵育消化后的文库；
④
消化后纯化向孵育消化后的文库中添加终止缓冲液后，添加1.1～1.8x磁珠进行纯化；纯化完成后使用Tris
‑
EDTA Buffer回收磁珠DNA；
⑤
Post～Second PC其上机PCR扩增的循环数为7～15cycle；
⑥
Post～Second PCR纯化；该步骤采用磁珠的纯化体系为0.5～1.5x，获得的文库，并...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐君南，赵毅，范星菊，
申请(专利权)人：辽宁康惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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