一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法技术

一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法，其属于生物技术领域。该试剂盒中包括组织裂解液和细胞裂解液；提取方法包括去除石蜡、样本组织破碎、样本DNA提取、样本DNA吸附、样本DNA洗涤、样本DNA洗脱。试剂盒中提供了样本组织裂解液和细胞裂解液的配方，样本组织细胞破碎时使用了裂解液的同时增加了使用高强度氧化锆珠研磨的方法。本发明专利技术去除石蜡过程简单，去除充分，真菌检出率高，充分释放组织中的遗传物质，缩短了提取时间，整个提取过程只需极少的样本即可准确检测到包括结核分枝杆菌等病原微生物基因组序列。等病原微生物基因组序列。

【技术实现步骤摘要】
一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及石蜡切片样本检测病原微生物宏基因组的方法。

技术介绍

[0002]高通量测序的宏基因组技术可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，通过数据库序列比对判断所有微生物信息，在临床检测中发挥着重要的作用。而采用基因检测分析方法最重要的是获得新鲜无污染的样本且样本可提取足够纯度和数量的核酸。由于石蜡包埋组织保存时间长，对保存环境要求不高，基于石蜡组织切片样本为材料进行基因检测筛查目前已成为临床诊断的常规手段；但在石蜡切片样本提取核酸过程中，由于组织包埋于石蜡固体中，使得提取核酸DNA过程困难，常规石蜡切片提取过程操作复杂，耗时较长，且常规的细胞裂解液包含氯仿等有毒试剂，且裂解细胞存在裂解不充分或是裂解过度，导致很难从细胞中提取出足够量的DNA用于做PCR基因型鉴定。

技术实现思路

[0003]为解决现有技术问题，本专利技术的目的是提供一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒及提取方法。针对微量样本建立高效的核酸提取方法，通过充分破碎组织细胞，改善提取核酸质量和含量差的问题，克服包括结核分枝杆菌等真菌细胞壁厚，破碎不充分，提取时间长等问题。为缩短提取时间，提高提取效率，建立基于宏基因组测序的疾病病原体检测和鉴定方法。氧化锆珠具有稳定性好，高强度，高密度、耐高温、耐腐蚀且成本低等优点，在核酸提取过程中使用氧化锆珠可在短时间内破碎裂解样本，可有效避免蛋白质的变性和核酸的降解且真菌检出率高。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0005]一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒，该试剂盒中包括组织裂解液和细胞裂解液，所述组织裂解液Buffer ATL包括PMSF 0.1
‑
1mol/L、Aprotinin 0.005
‑
0.2umol/L、硫脲1
‑
10mol/L、DTT 0.1
‑
1mol/L、NP
‑
40裂解液1％
‑
5％、Triton X
‑
100 0.5％
‑
1.5％、pharmalyte 1％
‑
5％、CHAPS 1％
‑
10％、Tris 0.01
‑
0.08mol/L、EDTA 0.1
‑
1mol/L。
[0006]所述细胞裂解液Buffer AL包括硫脲1
‑
10mol/L、脲1
‑
10mol/L、DTT 0.1
‑
1mol/L、CHAPS 1％
‑
10％、Tris 0.01
‑
0.08mol/L。
[0007]组织裂解液和细胞裂解液中涉及物质的百分比均为质量百分比。
[0008]一种石蜡组织切片样本提取结核分枝杆菌基因方法，包括了去除石蜡、样本组织破碎、样本DNA提取、样本DNA吸附、样本DNA洗涤和样本DNA洗脱。所述石蜡组织切片样本提取结核分枝杆菌基因的提取步骤如下：
[0009]S1去除石蜡：向装有组织切片的EP管中加入1
‑
2mL二甲苯，振荡混匀，室温离心16000g，2
‑
5min，弃上清，加入1
‑
2mL无水乙醇，室温离心16000g，2
‑
5min，弃上清。重复上述步骤1次后，打开EP管盖，37℃孵育10
‑
20min，直至残余乙醇全部挥发。
[0010]S2样本组织破碎：在已脱蜡的组织块切片管内加入360uL Buffer ATL，转移到研磨管内进行研磨；研磨后管中液体转移到新的2mL的离心管中。
[0011]S3样本DNA提取：向管内加入40
‑
60uL蛋白酶K，充分混匀，56℃水浴1
‑
2h；每隔15min颠倒混匀一次。90℃水浴1
‑
2h，短暂离心，迅速加入400uL Buffer AL和400uL无水乙醇，充分混匀，短暂离心；
[0012]S4样本DNA吸附：小心转移混合物于QIAamp层析柱中，20℃8000rpm离心1min，将柱子放入1个干净的收集管中；重复操作，将剩余混合液转入QIAamp层析柱中，过柱离心。
[0013]S5样本DNA洗涤：小心打开柱子，加入500uL洗涤液I，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，小心打开柱子，加入500uL洗涤液II，盖上盖子，20℃8000rpm离心3min，将柱子放入一个干净的收集管中，20℃16000rpm离心3min，使膜完全干燥(生物安全柜中静置3min)。
[0014]S6样本DNA洗脱：将柱子放入一个新的1.5mL干净的EP管中，小心打开柱子，加入50uL Buffer AE，室温盖上盖子静置5min，20℃16000rpm离心1min，洗脱DNA(
‑
20℃保存)。
[0015]所述步骤S2中，组织裂解液Buffer ATL配方为：PMSF 0.1
‑
1mol/L、Aprotinin 0.005
‑
0.2umol/L、硫脲1
‑
10mol/L、DTT 0.1
‑
1mol/L、NP
‑
40裂解液1％
‑
5％、Triton X
‑
100 0.5％
‑
1.5％、pharmalyte 1％
‑
5％、CHAPS 1％
‑
10％、Tris 0.01
‑
0.08mol/L、EDTA 0.1
‑
1mol/L。
[0016]所述步骤S2中的研磨管，内有3颗3mm氧化锆珠；5颗1mm氧化锆珠，研磨仪机器设置频率为50HZ，研磨时间50s。
[0017]所述步骤S3中，细胞裂解液Buffer AL配方为：硫脲1
‑
10mol/L、脲1
‑
10mol/L、DTT 0.1
‑
1mol/L、CHAPS 1％
‑
10％、Tris 0.01
‑
0.08mol/L。
[0018]所述步骤S3中，蛋白酶K浓度为10
‑
40g/L。
[0019]所述步骤S3中，蛋白酶K提前加到新管中提前56℃预热3min。
[0020]所述步骤S3中，90℃孵育前如有沉淀，进行10000g，3min进行离心，留上清90℃水浴1h，丢弃沉淀。
[0021]所述步骤S5中，洗涤液I用于去除蛋白质等杂质成分，pH6
‑
7，1
‑
10mmol/L Tris
‑
HCl，0.1
‑
1mol/L NaCl，10
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒，该试剂盒中包括组织裂解液和细胞裂解液，其特征在于：所述组织裂解液Buffer ATL包括PMSF 0.1
‑
1mol/L、Aprotinin 0.005
‑
0.2umol/L、硫脲1
‑
10mol/L、DTT 0.1
‑
1mol/L、NP
‑
40裂解液1％
‑
5％、Triton X
‑
100 0.5％
‑
1.5％、pharmalyte 1％
‑
5％、CHAPS 1％
‑
10％、Tris 0.01
‑
0.08mol/L、EDTA 0.1
‑
1mol/L；所述细胞裂解液Buffer AL包括硫脲1
‑
10mol/L、脲1
‑
10mol/L、DTT 0.1
‑
1mol/L、CHAPS 1％
‑
10％、Tris 0.01
‑
0.08mol/L；所述试剂盒中还包括洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ和Buffer AE；洗涤液I的包括为1
‑
10mmol/L Tris
‑
HCl，0.1
‑
1mol/L NaCl，10
‑
50％C2H5OH，0.5
‑
2mol/L CH5N3·
HCl，pH为6
‑
7；洗涤液II的包括为0.5
‑
2.5nmol/L NaAC，70
‑
85％C2H5OH，pH为6
‑
7；Buffer AE为9.5
‑
10.5mmol/L T ris
‑
HCl；0.8
‑
1.2mmol/L EDTA。2.根据权利要求1所述的一种石蜡切片宏基因组提取试剂盒提取宏基因组的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1去除石蜡：向装有组织切片的EP管中加入二甲苯，振荡混匀，室温离心16000g，弃上清；加入无水乙醇，室温离心16000g，弃上清；重复上述步骤1次后，打开EP管盖，37℃孵育，直至残余...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐君南，赵毅，范星菊，于丹，
申请(专利权)人：辽宁康惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：