一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用技术

本申请公开了一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用。该改性硅藻土对核酸扩增反应没有抑制作用且可以富集大量核酸，提高核酸可扩增反应灵敏度。将该改性硅藻土应用于扩增反应，可集核酸提取、扩增、检测于一体，结合快速扩增手段，整个反应可在40min内完成，降低了核酸检测成本，提高了检测效率。提高了检测效率。提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用


[0001]本申请涉及核酸提取
，尤其涉及一种改性硅藻土提取核酸的方法及应用。

技术介绍

[0002]基于核酸的分子诊断技术可以短时间检测病原样本中核酸，提高了检测效率，降低了检测成本。然而，基于核酸检测的传统方法需要对核酸进行繁琐的提取处理，对操作、试剂盒仪器配备要求高。现有提取方法主要有磁珠提取法和热裂解法，磁珠法试剂昂贵，提取样本量往往不足。热裂解法往往对核酸造成不可逆的结构破坏，降低了提取后检测的准确性。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种操作简单，无需复杂的反应溶剂和仪器，成本低，灵敏度高，特别适用于资源匮乏地区的核酸富集提取新方法，特别适用于下游分子生物学研究。
[0004]第一方面，本申请实施例公开了用于提取核酸的改性硅藻土，所述改性硅藻土具有硅藻土以及偶联在所述硅藻土表面的壳聚糖的结构。
[0005]本申请实施例中，所述壳聚糖分子量为1800～80000。
[0006]第二方面，本申请实施例公开了一种核酸提取方法，包括由向待提取样本中依次加入裂解液和第一方面所述的改性硅藻土的步骤；其中，所述裂解液用于从细胞、细菌、组织或有机体中释放出游离核酸，以便被所述改性硅藻土吸附提取。
[0007]在本申请实施例中，所述改性硅藻土吸附目的核酸的溶液pH值为4～6。
[0008]第三方面，本申请实施例公开了一种核酸检测方法，包括以下步骤：
[0009]获得第一方面所述的改性硅藻土；
[0010]向吸附核酸后的改性硅藻土中加入用于核酸扩增的反应体系；
[0011]扩增反应获得扩增产物；以及
[0012]检测所述扩增产物。
[0013]第四方面，本申请实施例公开了一种核酸提取试剂盒，包含第一方面所述的改性硅藻土。
[0014]第五方面，本申请实施例公开了一种核酸扩增试剂盒，包含第一方面所述的的含改性硅藻土。
[0015]第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的改性硅藻土的制备方法，该方法包括将硅藻土与壳聚糖通过(3
‑
乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷进行偶联反应得到；其中，所述壳聚糖的分子量为1800～80000，所述反应体系中壳聚糖的初始浓度为5～30mg/mL。
[0016]在本申请实施例中，所述反应体系中，(3
‑
乙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷的初始浓度为0.1～10％，乙酸的初始浓度为0.01～0.5mol/L。
[0017]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0018]本申请公开了一种改性硅藻土，其表面偶联壳聚糖，利用壳聚糖的等电点为6.3，在pH小于6.3时，由于静电吸附作用，带正电的壳聚糖会与带负电的核酸结合；在pH大于6.3时，壳聚糖与核酸分离，核酸被洗脱下来。
[0019]利用该改性硅藻土对核酸扩增反应没有抑制作用且可以富集大量核酸，提高了核酸扩增反应灵敏度。将该改性硅藻土应用于扩增扩增反应，可集核酸提取、扩增、检测于一体，结合快速扩增手段，整个反应可在40min内完成。
[0020]另外，本申请提供的核酸提取方法单次使用成本低于0.3元，相比于磁珠试剂盒提取，反应快速，具有更高的灵敏度，能够实现单拷贝靶标的检测。
附图说明
[0021]图1为本申请实施例1提供的改性硅藻土的红外图谱，谱线1对应硅藻土样本，谱线2对应改性硅藻土样本。
[0022]图2为本申请实施例1、对比例2～4分别提供的改性硅藻土对核酸吸附后洗脱液的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为15000bp Marker；泳道1：提取前的核酸样本；泳道2：实施例1提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道3：对比例2提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道4：对比例3提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道5：对比例4提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液。
[0023]图3为本申请实施例1～4和对比例1分别提供的改性硅藻土对核酸吸附后洗脱液的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为15000bp Marker；泳道1：提取前的核酸样本；泳道2：实施例3提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道3：对比例1提供的硅藻土提取样本的洗脱液；泳道4：实施例1提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道5：实施例2提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液；泳道6：实施例4提供的改性硅藻土提取样本的洗脱液。
[0024]图4为本申请实施例1提供的改性硅藻土在不同pH MES缓冲液中对核酸的提取效率结果图。
[0025]图5为本申请实施例1提供的改性硅藻土在不同pH MES缓冲液中对核酸提取的洗脱液琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为15000bp Marker；泳道1：提取前的核酸样本；泳道2：pH＝4MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道3：pH＝4.5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道4：pH＝5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道5：pH＝5.5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道6：pH＝6MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液；泳道7：pH＝6.5MES缓冲条件下提取样本后的洗脱液。
[0026]图6为本申请实施例1提供的改性硅藻土对核酸样本富集后的PCR扩增曲线；图中，－
■
－代表改性硅藻土提取并富集纯核酸的扩增曲线；－
●
－代表20μL反应体系中含有4μL纯核酸靶标直接扩增的曲线；－
▲
－代表20μL反应体系中不含靶标时的扩增曲线。
[0027]图7为本申请实施例提供的三种不同方法提取核酸样本富集后的PCR扩增曲线图；图中，－
■
－代表改性硅藻土提取并富集纯核酸的扩增曲线；－
▲
－代表磁珠法提取核酸的扩增曲线；－
●
－代表热裂解法提取核酸的扩增曲线；－*－代表20μL反应体系中不含靶标时的扩增曲线。
[0028]图8为本申请实施例1提供的改性硅藻土应用于沙门氏菌核酸检测结果图；图8A为
随样本沙门氏菌浓度的变化的PCR反应荧光曲线图；
[0029]图8B为沙门氏菌浓度对数与PCR扩增反应Ct值关系图；图8C为不同沙门氏菌浓度样本的电泳图；图8D为不同沙门氏菌浓度样本的荧光变化图(添加改性硅藻土和未添加改性硅藻土)；图8E为为不同沙门氏菌浓度样本对数与扩增反应Ct值关系图(添加改性硅藻土和未添加改性硅藻土)；样本1～6的沙门氏菌浓度分别为：1.0
×
105CFU/mL～1.0
×
100CFU/mL，7：阴性对照。
[0030]图9为本申请实施例1提供的改性硅藻土应用于沙门氏菌人工污染样本的核酸检测结果；图9A为来自牡蛎人工污染样本的浓度与Ct值关系图；图9B为来自鸡人工污染样本的浓度与Ct值关系图；图9C为来自羔羊人工污染样本的浓度与Ct值关系图；图9D为来自牡蛎人工污染样本的扩增反应产物的荧光变化图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取核酸的改性硅藻土，所述改性硅藻土具有硅藻土以及偶联在所述硅藻土表面的壳聚糖的结构。2.根据权利要求1所述的改性硅藻土，其特征在于，所述壳聚糖分子量为1800～80000。3.一种核酸提取方法，包括由向待提取样本中依次加入裂解液和如权利要求1或2所述的改性硅藻土的步骤；其中，所述裂解液用于从细胞、细菌、组织或有机体中释放出游离核酸，以便被所述改性硅藻土吸附提取。4.根据权利要求3所述的核酸提取方法，其特征在于，所述改性硅藻土吸附目的核酸的溶液pH值为4～6。5.一种核酸检测方法，包括以下步骤：获得如权利要求1或2所述的改性硅藻土；向吸附核酸后的改性硅藻土中加入用于核酸扩增的反应体系；扩增反应获...

【专利技术属性】
技术研发人员：马翠萍，石超，万千一，姬艳丽，赵晓丽，张健，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：