一种同时分离外泌体和细胞核的方法以及一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法技术

本发明专利技术提供了一种同时分离外泌体和细胞核的方法以及一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术建立了在同一组织中进行外泌体提取及单细胞核制备的方法。目前并未有在同一组织中同时分离外泌体和细胞核的技术。本发明专利技术提供的技术方案解决了这一问题，填补了技术空白。本发明专利技术的方法能够同时获得同一组织的外泌体和细胞核，进而能够实现在同时检测同一组织中外泌体中小RNA表达及单细胞转录组。本发明专利技术提供的技术方案可以在同一份样本中得到更多有意义的数据，挖掘到更深层次的生物学信息。深层次的生物学信息。深层次的生物学信息。

【技术实现步骤摘要】
一种同时分离外泌体和细胞核的方法以及一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种同时分离外泌体和细胞核的方法以及一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是由细胞分泌的，直径介于50～200nm的细胞外囊泡(ExtracellularVesicles,EVs)，是细胞相互进行细胞间通讯的主要载体。已知外泌体中小RNA在癌症等疾病诊断、肿瘤细胞转移、肿瘤微环境调控等过程中扮演关键角色，是生命科学研究的主要对象。通过测序外泌体中small RNA，能够研究潜在生物标志物，预测分子潜在功能，挖掘通路分子间相互作用模式，揭示生命活动胞间信号通讯机制，探索复杂生命活动形态。
[0003]单细胞转录组测序(Single cell RNAsequencing)是在单细胞水平对转录组进行测序的一项新技术，可以研究单个细胞内的基因表达情况，同时解决用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题，让解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系成为了现实。单细胞转录组测序因其能够以单个细胞的分辨力揭示生命现象背后的运作机制，目前已成为生命科学领域的核心研究手段与工具。近年来快速发展的单细胞核测序技术解决了常规使用完整细胞进行单细胞测序的一些主要问题，极大的提升了数据的真实性和可靠性，为生命科学研究带来了突破性发展。
[0004]从本质上来说，生命现象是由不同细胞之间的互作所推动和展现的，即：生命是细胞的互作网络。因此，同时测序组织中的外泌体small RNA与单细胞核转录组，通过单细胞核测序解析网络节点的特性，通过外泌体small RNA测序解析网络节点之间的通讯信号，两者结合能够挖掘更系统、详尽的网络运作机制，解答更复杂的生物学问题，洞悉更深刻的生物学机制，为生命科学研究带来革命性的发展。
[0005]但目前尚未有任何技术方案可以实现同一组织中同时开展外泌体small RNA测序及单细胞核测序，这其中有一个关键技术问题需要解决，即如何同时分离同一组织的外泌体和细胞核。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种同时分离外泌体和细胞核的方法以及一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法。
[0007]本专利技术提供了一种同时分离外泌体和细胞核的方法，包括以下步骤：
[0008]1)将待提取的组织和匀浆缓冲液混合匀浆，得到破碎组织；对所述破碎组织进行第一离心，得到第一上清液和第一沉淀；
[0009]所述匀浆的浆液温度为0～5℃，所述匀浆的时间≤10s；所述匀浆缓冲液以PBS为基础，还含有浓度为1～2U/μL的RNase抑制剂；
[0010]所述第一离心的相对离心力为2000～3000g；
[0011]2)对所述第一上清液进行第二离心，得到第二上清液，对所述第二上清液进行第一过滤，得到第一滤液；所述第一滤液中包含外泌体；所述第一过滤的过滤孔径为0.22μm；所述第二离心的相对离心力≥15000g；
[0012]3)将所述第一沉淀和裂解缓冲液混合，进行裂解，得到裂解液；
[0013]4)采用细胞筛对所述裂解液进行第二过滤，得到第二滤液，对所述第二滤液进行第三离心，得到第三沉淀；所述第三沉淀中包含细胞核；所述第三离心的离心力为800～1000g；
[0014]所述步骤2)和步骤3)、步骤2)和步骤4)之间之间没有时间顺序限制。
[0015]优选的，步骤2)中，所述第一过滤后还包括：采用exoEasy Maxi Kit试剂盒对所述第一滤液中的外泌体进行纯化。
[0016]优选的，步骤3)中，所述的裂解缓冲液包括以下浓度的组分：10mM Tris
‑
HCl、1mM CaCl2、5mM NaCl、体积浓度为0.1％～0.2％的TritonX
‑
100、体积浓度为0.1％～0.2％的吐温20和0.4U/μLRNA酶抑制剂；所述Tris
‑
HCl的pH值为7.5。
[0017]优选的，步骤4)中，所述第二过滤的次数为2次，第一次第二过滤所采用的细胞筛的孔径为40μm，第二次第二过滤所采用的细胞筛的孔径为30μm。
[0018]优选的，步骤4)中所述第三离心的时间为10～15min。
[0019]优选的，步骤4)中，所述第三离心后还包括：重悬所述第三沉淀，采用去碎片试剂对重悬的第三沉淀进行去碎片纯化处理，得到纯化后的细胞核沉淀。
[0020]优选的，得到去碎片纯化处理后还包括：采用洗涤缓冲液对得到的细胞核沉淀进行洗涤，所述洗涤包括：将所述去碎片纯化处理得到的细胞核沉淀和洗涤缓冲液混合，第四离心弃上清，得到洁净细胞核沉淀；所述洗涤次数≤5次；所述第四离心的离心力≤500g。
[0021]优选的，所述洗涤次数为2～5次，所述第四离心的离心力为300～500g；所述第四离心的时间为5～10min。
[0022]本专利技术还提供了一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法，包括以下步骤：
[0023]采用上述方案所述方法制备得到外泌体和细胞核沉淀；
[0024]对所述细胞核沉淀进行单细胞测序；
[0025]提取所述外泌体中的小RNA，对所述小RNA进行建库，进行NGS测序。
[0026]优选的，提取所述外泌体中的小RNA采用miRNeasy Serum/PlasmaKit试剂盒进行。
[0027]本专利技术提供了一种同时分离外泌体和细胞核的方法。本专利技术建立了在同一组织中进行外泌体提取及单细胞核制备的方法。本专利技术通过采用特定的匀浆手段得到含有细胞核和外泌体的混合液，通过采用特定的分离手段，使外泌体和细胞核分离，本专利技术的方法能够同步分离同一组织中的外泌体和细胞核，填补了在在同一组织中同时分离外泌体和细胞核的技术空白。
[0028]本专利技术的方法能够同时获得同一组织的外泌体和细胞核，进而能够实现同时检测同一组织中外泌体中小RNA表达及单细胞转录组。本专利技术提供的技术方案可以在同一份样本中得到更多有意义的数据，挖掘到更深层次的生物学信息。现有单细胞测序技术能够很好的解析网络中的单个节点，但对于节点之间的通讯信号，即不同细胞之间是如何相互沟通以协调工作的，仅仅通过单细胞测序很难挖掘到深入的信息。本专利技术提供的技术方案增
加了最主要的通讯介质外泌体中的信息，从而丰富了研究数据，为挖掘更深层次的生物学机理提供了基础。此外，当前单细胞核测序过程中，细胞核的制备会“丢弃”细胞质、细胞外基质等部分，而其中包含有外泌体等细胞外囊泡。本专利技术将细胞核的制备过程中的外泌体利用起来，提高了样本的使用效率，同时又揭示了更深入的生物学机制。
附图说明
[0029]图1是小鼠肾脏裂核洗涤后镜检结果；
[0030]图2是小鼠肝脏裂核洗涤后镜检结果；
[0031]图3是小鼠肺脏裂核洗涤后镜检结果；
[0032]图4是小鼠心脏裂核洗涤后镜检结果；
[0033]图5是小鼠脾脏裂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时分离外泌体和细胞核的方法，包括以下步骤：1)将待提取的组织和匀浆缓冲液混合匀浆，得到破碎组织；对所述破碎组织进行第一离心，得到第一上清液和第一沉淀；所述匀浆的浆液温度为0～5℃，所述匀浆的时间≤10s；所述匀浆缓冲液以PBS为基础，还含有浓度为1～2U/μL的RNase抑制剂；所述第一离心的相对离心力为2000～3000g；2)对所述第一上清液进行第二离心，得到第二上清液，对所述第二上清液进行第一过滤，得到第一滤液；所述第一滤液中包含外泌体；所述第一过滤的过滤孔径为0.22μm；所述第二离心的相对离心力≥15000g；3)将所述第一沉淀和裂解缓冲液混合，进行裂解，得到裂解液；4)采用细胞筛对所述裂解液进行第二过滤，得到第二滤液，对所述第二滤液进行第三离心，得到第三沉淀；所述第三沉淀中包含细胞核；所述第三离心的离心力为800～1000g；所述步骤2)和步骤3)、步骤2)和步骤4)之间之间没有时间顺序限制。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述第一过滤后还包括：采用exoEasy Maxi Kit试剂盒对所述第一滤液中的外泌体进行纯化。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的裂解缓冲液包括以下浓度的组分：10mM Tris
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HCl、1mM CaCl2、5mM NaCl、体积浓度为0.1％～0.2％的TritonX
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100、体积浓度为0.1％～0.2％的吐温20和0.4U/μLRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟思雨，殷昊，肖云平，朱燕敏，王佳琦，范黎明，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：