一种适用于拟南芥叶片组织同时制备原生质体和单细胞核的方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种拟南芥叶片组织同时制备原生质体和单细胞核的方法及应用

【技术实现步骤摘要】
一种适用于拟南芥叶片组织同时制备原生质体和单细胞核的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物学
，具体涉及一种适用于拟南芥叶片组织同时制备原生质体和单细胞核的方法并对同一叶片组织同时进行单细胞测序与单细胞核测序，以获取其遗传信息
。

技术介绍

[0002]单细胞转录组分析广泛应用于人类和动物模型，以揭示组织或器官不同细胞类型之间的基因表达异质性
。
目前，单细胞测序技术已在肿瘤
、
免疫
、
发育等方向获得了良好的应用，但植物单细胞研究仍处于发展阶段
。
[0003]单细胞分析需要分离和标记来自每个细胞的信使
RNA(mRNA)。
植物研究领域中，模式植物原生质体的分离目前已基本稳定，但植物单细胞测序存在着一定的缺陷
。
原生质体分离在实际应用过程中，植物组织伴随着发育程度不同和功能不同，具有不同的细胞壁厚度和液泡渗透压，植物细胞壁酶消化过程作为一种胁迫，容易刺激植物细胞产生应激反应，诱导部分压力应答基因表达，引起部分细胞丢失，导致制备到的原生质体群体中细胞类型的不平等
。
这一限制对于位于组织内层或器官内部组织的细胞类型尤其重要，不利于全面深入研究植物细胞发育的生物学过程
。
[0004]开展植物单细胞核测序可以弥补一些植物单细胞测序的不足，降低人为引入的转录偏差，相对提高细胞类型的全面性
。
由于细胞核膜稳定性高于细胞膜，植物单细胞核测序的样本类型较植物单细胞测序更为丰富
。
同样地，植物单细胞核测序也存在一定的缺陷
。
植物单细胞核测序无法获取细胞质中游离的
mRNA
信息，只能检测到细胞核中的
mRNA。
[0005]基于此，在同一份组织中制备植物原生质体和单细胞核，同时开展单细胞测序和单细胞核测序，为解决以上的缺陷带来可能
。
本专利技术以模式植物拟南芥为例，探索出一种尽可能全面的获取组织细胞类型的实验方法，这对全面绘制植物细胞图谱，深入研究植物细胞生物学功能有关键性作用
。
这其中有一个关键性的技术问题就是，如何同时制备植物同一组织的原生质体和细胞核，以实现对植物同一组织同时开展单细胞测序和单细胞核测序的目的
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，创新提出了一种适用于拟南芥叶片组织同时制备原生质体和单细胞核的方法，以及同时制备原生质体和单细胞核的方法并对同一叶片组织同时进行单细胞测序与单细胞核测序，以获取其遗传信息
。
[0007]本专利技术提供了一种同时制备同一拟南芥组织原生质体和单细胞核的方法及其应用
。
本专利技术采取的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种从同一拟南芥叶片组织中分离原生质体和单细胞核的提取方法，包括以下步骤：
[0009](1)
剪取拟南芥叶片，冲洗干净后将其均匀切割成细条，将其放入培养皿中，加入
WI
缓冲液研磨，而后转移至装有酶解液的培养皿中，置于恒温混匀仪上避光消化，得消化液和消化后的拟南芥叶片组织
。
[0010](2)
取消化液缓慢过筛，得过筛上清液和消化后和剩余拟南芥叶片组织，
WI
缓冲液漂洗剩余组织后，将漂洗液过滤至过筛上清液中，得过滤液，过滤液包含原生质体，保留剩余拟南芥叶片组织
。
[0011](3)
将上述过滤液进行第一次离心，弃上清液得沉淀，
WI
缓冲液重悬沉淀后进行第二次离心洗涤，弃上清液得沉淀，
WI
缓冲液重悬沉淀即得原生质体悬液，镜检计数
。
[0012](4)
将步骤2保留的消化后剩余拟南芥叶片组织转移至
EP
管中，向管中加入钢珠，液氮粉碎后加入裂解液裂解
。
[0013](5)
往孵育后的裂解液中补充清洗缓冲液
Wash Buffer
过筛，得过筛上清液
。
[0014](6)
将过筛上清液进行两次离心洗涤，弃上清后留沉淀，清洗缓冲液
Wash Buffer
重悬即得单细胞核悬液，镜检计数
。
[0015]作为本专利技术所述的拟南芥叶片组织原生质体和单细胞核的提取方法的优选实施方式，在步骤
(1)
中，所述酶解液中包含有2％的纤维素酶
RS(Solarbio
：
C8290
‑
1G)、0.4
％
(m/v)
的离析酶
R
‑
10(Solarbio
：
M8190
‑
1G)、0.5
～1％
(m/v)
的木聚糖酶
(
源叶：
X2753
‑
10G)、8
％
(m/v)
的山梨糖醇
(Solarbio
：
60319ES76)、20mM
的
MES(PH
＝
5.7)(Sigma
：
M3671
‑
50G)、20mM
的
KCl(Sigma
：
P9541
‑
500G)、10mM
的
CaCl2(Sigma
：
93639
‑
100G)、0.1
％
(v/v)BSA(MACS
：
130091376)
和无菌水
。
[0016]所述避光消化条件为
37℃、200RPM
，此外，避光消化时间每间隔
20min
则需观察消化液和消化液中组织的状态，若组织沉入消化液底部
、
消化液呈现浑浊状，则吸取
15
μ
L
消化液，显微镜下观察原生质体数目和状态，计算酶解得到的原生质体总数
。
[0017]所述切割的组织薄片宽度为2‑
4mm。
[0018]所述培养皿是指直径为
35mm
的培养皿
。
[0019]所述
WI
缓冲液中包含有
0.5M
的甘露醇
、4mM
的
MES(PH
＝
5.7)
和
20mM
的
KCl。
[0020]作为本专利技术所述的拟南芥叶片组织原生质体和单细胞核的提取方法的优选实施方式，在步骤
(2)
中，所述过筛时使用
40
μ
m
细胞筛，所述
WI
缓冲液中包含有
0.5M...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种适用于拟南芥叶片组织同时制备原生质体和单细胞核的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：
(1)
剪取拟南芥叶片，冲洗干净后将其均匀切割成细条，将其放入培养皿中，加入
WI
缓冲液研磨，而后转移至装有酶解液的培养皿中，置于恒温混匀仪上避光消化，得消化液和消化后的拟南芥叶片组织；
(2)
取消化液缓慢过筛，得过筛上清液和消化后和剩余拟南芥叶片组织，
WI
缓冲液漂洗剩余组织后，将漂洗液过滤至过筛上清液中，得过滤液，过滤液包含原生质体，保留剩余拟南芥叶片组织；
(3)
将上述过滤液进行第一次离心，弃上清液得沉淀，缓冲液重悬沉淀后进行第二次离心洗涤，弃上清液得沉淀，缓冲液重悬沉淀即得原生质体悬液，镜检计数；
(4)
将所述步骤
(2)
保留的消化后剩余拟南芥叶片组织转移至
EP
管中，向管中加入钢珠，液氮粉碎后加入裂解液裂解；
(5)
往孵育后的裂解液中补充清洗缓冲液过筛，得过筛上清液；
(6)
将过筛上清液进行两次离心洗涤，弃上清后留沉淀，清洗缓冲液重悬即得单细胞核悬液，镜检计数
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，步骤
(1)
中，所述切割的组织薄片宽度为2‑
4mm。3.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，步骤
(1)
中，所述酶解液中含有2％的纤维素酶
RS、0.4
％
(m/v)
的离析酶
R
‑
10、0.5
～1％
(m/v)
的木聚糖酶
、8
％
(m/v)
的山梨糖醇
、20mM
的
MES(PH
＝
5.7)、20mM
的
KCl、10mM
的
CaCl2和
0.1
％
(v/v)BSA。4.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，步骤
(3)
中，所述第一次和第二次离心时的温度均为
4℃
，
100
×
g
，离心升降速率为0，时间处于7～
10min
中
。5.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，步骤
(4)
中，所述裂解液中含有
45mM
的
MgCl2、20mM
的
CaCl2、20mM
的3‑
吗啉丙磺酸
(MOPS)、30mM
的柠檬酸钠
、5
％
(m/v)
的葡聚糖
T
‑
40(Dextran T40)、1
％
(w/v)
的聚乙烯吡咯烷酮
(PVP40)、0.2
％
(v/v)
的免疫染色通透液
TritonX
‑
100、10mM
的
EDTA
‑
Na2、20
μ
L/mL
的巯基乙醇和
0.4U/
μ
L
的
RNase Inhibitor。6.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，步骤
(5)
中，所述缓冲液中含有
0.5
～1％的
TritionX
‑
100、1
％的
BSA、0.2U/
μ
L
的
RNAse inhibitor
和
PBS。7.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，步骤
(5)
中，所述过...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐高红，王佳琦，朱燕敏，范黎明，殷昊，王树伟，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：