一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法技术

本发明专利技术属于植物单细胞提取领域，尤其涉及一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法

【技术实现步骤摘要】
一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法


[0001]本专利技术涉及植物单细胞提取领域，具体是指一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法
。

技术介绍

[0002]半枝莲为唇形科黄岑属多年生草本植物，可全草入药，含有苯丙氨酸
、
生物碱
、
黄酮苷
、
皂苷
、
多糖等成分
。
临床上对于半枝莲的化学成分研究较为充分，但对其抗病的分子机制研究尚属空白，建立半枝莲遗传性能稳定的单细胞群落，有助于未来研究其具体抗肿瘤作用位点和机理
。
现有单细胞提取方式只能提取到原生质体，并不包括细胞壁，无法保证植物单细胞结构的完整性；或通过亚氯酸钠处理生物质材料进行脱木素反应，植物细胞木质素及半纤维素脱除，获得完整单细胞，但只适用于木本
、
禾本植物；压电技术制备植物单细胞样本，极易导致细胞的损坏和破碎，且操作方式繁琐
。

技术实现思路

[0003]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法，为解决现有单细胞提取方法，只能提取得到原生质体，不包括细胞壁，本专利技术提出通过选取半枝莲幼嫩叶片为实验材料，获得大量疏松的愈伤组织，便于后续完整单细胞悬浮液的制备；同时选用含有多聚半乳糖醛酸酶
、
吗啉乙磺酸
、
风车子抑素
A4
的单细胞液体培养基，可以选择性的在溶解细胞间物质的同时不破坏植物细胞壁结构，促进形成完整单细胞集合体；此外，采用纤维素
、
木质素
、
葡萄糖和甘油制备细胞稳定液，能够将收集好的单细胞进行完整保存，解决了所制植物单细胞极易损坏和破碎的问题
。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下，本专利技术提出了一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法，其中，所述半枝莲完整单细胞提取方法包括如下步骤：（1）选择健壮新鲜半枝莲植株，选取上部幼嫩叶片，使用无菌去离子水冲洗干净，得到半枝莲原材料；（2）在超净工作台中，将半枝莲原材料使用
70%
酒精浸泡
15
‑
30 s
，再使用无菌去离子水冲洗2‑4次，使用剪刀将半枝莲原材料剪成小块，得到半枝莲叶片组织；（3）以
MS
培养基为基础培养基，其中6‑
苄氨基嘌呤的浓度为1‑
3 mg/L、
蔗糖的浓度为
20
‑
35 g/L、
琼脂粉的浓度为4‑
6 g/L
，在玻璃烧杯中混合温度为
40
‑
60℃、
混合转速为
180
‑
200 r/min、
混合时间为5‑
8 min、
调节
pH
为
5.5
‑
6.5
，充分搅拌，得到诱导愈伤组织培养基；以
1/2MS
培养基为基础培养基，其中，风车子抑素
A4
的浓度为5‑
8 mg/L、
吗啉乙磺酸的浓度为
15
‑
20 mg/L、
多聚半乳糖醛酸酶的浓度为3‑
5 mg/L、2,4
‑
二氯苯氧乙酸的浓度为1‑
2 mg/L、6
‑
糖基氨基嘌呤的浓度为
0.4
‑
0.6 mg/L
，在玻璃烧杯中混合温度为
20
‑
28℃、
混合转速为
180
‑
200 r/min、
混合时间为5‑
8 min、
调节
pH
为
5.5
‑
6.0
，充分搅拌，得到单细胞液体培养基；（4）将半枝莲叶片组织放至诱导愈伤组织培养基中恒温
27
‑
29℃
，培养时间为
12
‑
16 d
，得到大量疏松的愈伤组织；（5）使用灭菌的镊子挑取愈伤组织，将其转移至单细胞液体培养基中，在摇床温度为
20
‑
28℃、100
‑
150 r/min
振荡速度
、
培养时间为
12
‑
24 h
，振荡培养得到完整单细胞悬浮液；（6）以
100
‑
300
目细胞过滤筛，过滤除去完整单细胞悬液中的大块细胞团，得到细胞滤液；（7）将细胞滤液以
500
‑
800 r/min
的转速离心8‑
12 min
，去除上部细胞碎片，采用
40
‑
60
目细胞过滤筛过滤，得到半枝莲完整单细胞；（8）以
50%
甘油为溶剂，其中纤维素的浓度为5‑
8 g/L、
木质素的浓度为2‑
4 g/L、
葡萄糖的浓度为3‑
6 g/L
，充分混匀，得到单细胞稳定剂；（9）将回收的半枝莲完整单细胞分装于
2mL
无菌冻存管中，加入单细胞稳定剂，体积比为
1:1
，于
‑
80℃
冷冻保存
。
[0005]优选地，步骤（1）中，所述健壮新鲜半枝莲植株选用无菌半枝莲组培幼苗
。
[0006]优选地，步骤（2）中，所述半枝莲原材料使用
70%
酒精浸泡浸泡
25 s
，再使用去离子水冲洗3次
。
[0007]优选地，步骤（3）中，所述诱导愈伤组织培养基，其中6‑
苄氨基嘌呤的浓度为
2 mg/L、
蔗糖的浓度为
25 g/L、
琼脂粉的浓度为
5 g/L
，在玻璃烧杯中混合温度为
55℃、
混合转速为
190 r/min、
混合时间为
7 min、
调节
pH
为
6.0
；所述单细胞液体培养基中，风车子抑素
A4
的浓度为
6 mg/L、
吗啉乙磺酸的浓度为
18 mg/L、
多聚半乳糖醛酸酶的浓度为
4 mg/L、2,4
‑
二氯苯氧乙酸的浓度为
1.5 mg/L、6
‑
糖基氨基嘌呤的浓度为
0.5 mg/L
，在玻璃烧杯中混合温度为
22℃、
混合转速为
185 r/min、
混合时间为
6 min、
调节
pH
为
5.6。
[0008]优选地，步骤（4）中，所述半枝莲叶片组织培养时间为
14 d
；步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种半枝莲完整单细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）选择健壮新鲜半枝莲植株，选取上部幼嫩叶片，使用无菌去离子水冲洗，得到半枝莲原材料；（2）在超净工作台中，将半枝莲原材料使用
70%
酒精浸泡
15
‑
30 s
，再使用无菌去离子水冲洗2‑4次，使用剪刀将半枝莲原材料剪成小块，得到半枝莲叶片组织；（3）以
MS
培养基为基础培养基，其中6‑
苄氨基嘌呤的浓度为1‑
3 mg/L、
蔗糖的浓度为
20
‑
35 g/L、
琼脂粉的浓度为4‑
6 g/L
，在玻璃烧杯中混合温度为
40
‑
60℃、
混合转速为
180
‑
200 r/min、
混合时间为5‑
8 min、
调节
pH
为
5.5
‑
6.5
，充分搅拌，得到诱导愈伤组织培养基；以
1/2MS
培养基为基础培养基，其中，风车子抑素
A4
的浓度为5‑
8 mg/L、
吗啉乙磺酸的浓度为
15
‑
20 mg/L、
多聚半乳糖醛酸酶的浓度为3‑
5 mg/L、2,4
‑
二氯苯氧乙酸的浓度为1‑
2 mg/L、6
‑
糖基氨基嘌呤的浓度为
0.4
‑
0.6 mg/L
，在玻璃烧杯中混合温度为
20
‑
28℃、
混合转速为
180
‑
200 r/min、
混合时间为5‑
8 min、
调节
pH
为
5.5
‑
6.0
，充分搅拌，得到单细胞液体培养基；（4）将半枝莲叶片组织放至诱导愈伤组织培养基中恒温
27
‑
29℃
，培养时间为
12
‑
16 d
，得到大量疏松的愈伤组织；（5）使用灭菌的镊子挑取愈伤组织，将其转移至单细胞液体培养基中，在摇床温度为
20
‑
28℃、100
‑
150 r/min
振荡速度
、
培养时间为
12
‑
24 h
，振荡培养得到完整单细胞悬浮液；（6）以
100
‑
300
目细胞过滤筛，过滤除去完整单细胞悬液中的大块细胞团，得到细胞滤液；（7）将细胞滤液以
500
‑
800 r/min
的转速离心8‑
12 min
，去除上部细胞碎片，采用
40
‑
60
目细胞过滤筛过滤，得到半枝莲完整单细胞；（8）以
50%
甘油为溶剂，其中纤维素的浓度为5‑
8 g/L、
木质素的浓度为2‑
4 g/L、
葡萄糖的浓度为3‑
6 g/L
，充分混匀，得到单细胞稳定剂；（9）将回收的半枝莲完整单细胞分装于
2mL
无菌冻存管中，加入单细胞稳定剂，体积比为
1:1
，于
‑
80℃
冷冻保存
。2.
根据权利要求1所述的一种半枝莲完整单细胞提取方法，其特征在于，步骤（1）中，所述健壮新鲜半枝莲植株选用无菌半枝莲组培幼苗；步骤（2）中，所述半枝莲原材料使用
70%
酒精浸泡浸泡
25 s
，再使用去离子水冲洗3次
...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪华，陈晓宣，
申请(专利权)人：重庆佰东生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：