一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法技术

本发明专利技术公开了一种从同一肝内胆管组织样本出发，基于同一组织样本同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法。本发明专利技术所述的方法可以在同一份样本中得到更多有意义的数据，挖掘到更深层次的生物学信息，从而解析出生物现象背后这个网络最关键的一个动态机制。本发明专利技术创新改进地将外泌体制备、单细胞悬液制备和单细胞核悬液制备三种技术相结合，突破了现有的技术障碍，得到样本中更全面的细胞类型的同时，又真正解析了生命现象背后这种细胞互作的网络机制(既能了解单个细胞的功能，又能了解细胞之间是如何传递信号的以及特定的细胞对信号会有什么响应。)从而丰富了研究数据，为挖掘更深层次的生物学机理提供了基础。础。

【技术实现步骤摘要】
一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于同一人肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法，及同时进行外泌体small RNA测序、单细胞测序和单细胞核测序的方法，以及用于单细胞及单细胞核悬液制备的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]组织或器官的发育、机体的内稳态平衡等均有赖于不同细胞之间通讯。正是通过不同的信号分子，各种各样的细胞才能井然有序的彼此协调一致，从而展现出多种多样的生命现象。因此，生命的本质是不同类型细胞间的相互作所组成的网络。对于这种互作网络，我们需要了解单个细胞功能的同时，也了解细胞之间是如何传递信号的，即细胞互作网络中的通讯信号。两者的结合能够“重构”完整的细胞互作网络，从而去更深入的揭示生命现象背后的分子机制。所以我们只有把这两部分同时发掘出来，才能真正的挖掘出这个网络背后运作的机制。
[0003]单细胞测序自问世以来，已经在基础科研与工业界得到了广泛的关注，是一项非常有前景的技术。与传统的全基因组测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从同一肝内胆管组织样本出发，基于同一组织样本同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)样本准备：取人肝内胆管组织，清洗，剪碎，并将剪碎的组织块转移至离心管中；(二)酶解：加入培养基，加入胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶溶液进行37℃消化酶解，37℃酶解结束后加入胰酶溶液，混匀后室温静置；(三)分离：室温静置后得到第一上清液、第一沉降的组织沉淀，收集的第一上清液进行第一次离心分离再次得到第二上清液、第二细胞沉淀；(四)外泌体制备：取前述步骤(三)中第二上清液再次进行第二次离心处理，得到第三上清液与第三细胞沉淀；离心结束后，取上述第三上清液进行过筛处理，结束后采用Invitrogen
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Total Exosome Isolation Reagent from cell culture media试剂盒对所述第三滤液进行外泌体纯化；(五)悬液制备：单细胞悬液的制备：取前述步骤(三)中第二细胞沉淀与第三细胞沉淀分别使用培养基重悬后，转移到同一离心管中，进行过筛处理；过筛处理结束后进行第一次离心处理，离心结束后弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打混匀后室温静置，裂红结束后进行第二次离心处理，离心结束后弃上清，加入去死细胞试剂(磁珠)对细胞沉淀进行重悬，并孵育15min后，用1
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building buffer润洗LS柱，将细胞混合液过柱后，第三次离心处理，离心结束后弃上清，加入预冷的培养基对细胞沉淀进行第四次离心洗涤处理，离心结束后弃上清，加入预冷的培养基对细胞沉淀进行重悬处理，得到单细胞悬液；单细胞核悬液的制备：取前述步骤(三)中第一沉降的组织沉淀，使用PBS进行洗涤处理、第一次离心洗涤弃上清后，再次加入PBS洗涤，洗涤结束后加入裂解缓冲液重悬组织沉淀开始裂解处理，整个过程置于冰上孵育，裂解结束后进行过筛处理，过筛后收集滤液，第二次离心处理后弃上清，加入洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀，第三次离心洗涤后弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到单细胞核悬液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(一)中，所述人肝内胆管组织的鲜重为500～800mg；和/或，所述清洗的次数为1～4次。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(二)中，所述的培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA；和/或，所述的胰酶溶液是指将胰酶冻干粉溶于PBS中，配置浓度为2.5％(m/v)的胰酶溶液；和/或，所述的胶原酶Ⅱ溶液是指将胶原酶冻干粉溶于含有钙镁离子的HBSS溶液中，配置浓度为1％(m/v)的胶原酶溶液；和/或，所述的胶原酶Ⅳ溶液是指将胶原酶冻干粉溶于含有钙镁离子的HBSS溶液中，配置浓度为1％(m/v)的胶原酶溶液。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(三)中，所述的第一次离心条件为2000～3000
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g、5～10min、4～6℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(四)中，所述的第二次离心条件为13000
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g～16000
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g、5～10min、4～6℃。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(五)中，单细胞悬液的制备中：所述第一次离心条件为500～800
...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟思雨，殷昊，肖云平，范黎明，朱燕敏，王佳琦，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：