一种提取RNA的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种提取RNA的试剂盒及其应用。本发明专利技术采用脱氧核糖核酸酶(DNase)在磁珠法提取过程中进行DNA消化，其反应环境既能满足脱氧核糖核酸酶(DNase)的最适反应环境需求；同时提供了磁珠吸附时的疏水性环境，保证核酸的得率；还通过加入一种油的乳化液增大提取操作时的总体积，以促进仪器自动化提取操作的便利性。所提取的RNA产量高、纯度高，该方法能够轻松实现仪器自动化提取。解决了临床实际应用过程中快速便捷的提取高纯度RNA的需求，极大地降低了高纯度RNA提取难度和提取成本，所提取的RNA能很好地适应于后续RT

【技术实现步骤摘要】
一种提取RNA的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物样本纯化领域，尤其涉及一种无DNA污染磁珠法提取RNA的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]RNA作为存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，其提取与纯化是各种临床检测应用的基础，在RNA纯化的过程中，去除DNA是一个非常重要的环节,DNA去除不彻底很可能会影响下游实验的进行。目前常见的提取RNA的方法主要通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA。该方法能够得到纯度较高的RNA,但是在提取RNA的过程中使用了氯仿等毒性较大的化学品，且实验操作复杂不能实现自动化。
[0003]磁珠法作为核酸提取的一种重要方法，因其适用于实现仪器自动化，被广泛应用于病毒RNA的提取检测中。但该方法将RNA和DNA同时提取出来，因此DNA的污染限制了下游实验的应用。例如，临床上通过检测高危型HPV E6/E7 mRNA的转录应用于宫颈癌的早期诊断、早期治疗及预后监测，其检测靶标为mRNA，DNA的干扰会影响检测结果。
[0004]申请公布号CN 114350650 A的专利技术专利公开了一种无DNA残留血液RNA提取试剂盒及核酸提取方法，包括裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液、蛋白酶K缓冲液、无RNA酶的双蒸水,还包括红细胞裂解液，DNA酶缓冲液。细胞裂解后经第一漂洗液洗涤后，在吸附柱上加入DNA酶缓冲液和DNA酶进行消化，从而达到去除DNA的目的。然后再经第一漂洗液、第二漂洗液洗涤，最后洗脱获得RNA。该方法虽然可获得高纯度的RNA，但采用的是吸附柱式提取，不利于实现仪器自动化。
[0005]申请公布号CN 110607395 A的专利技术专利公开了一种横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，其提取和纯化方式采用常规磁珠法，其特征还在于使用磁珠法核酸提取纯化试剂，选用与RNA亲和力优于DNA的硅基磁珠，并可在提取纯化中可选加DNA酶消化的步骤。该专利提出在蛋白酶K消化过程中加入DNA酶进行DNA消化，基于既往的认知，DNA酶作为一种蛋白应该会被蛋白酶K消化失活，常见的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50
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100mM以上盐浓度均对DNaseⅠ有显著抑制作用。因此，此环境不能提供给DNA酶反应的有利环境，且专利中未提供详尽的实施例数据和结果展示，DNA酶消化的效果未可知。
[0006]申请公布号CN 108949747 A的专利技术专利公开了一种磁珠法提取核糖核酸(RNA)的试剂盒及提取方法，所述试剂盒包括试剂：组织消化液、裂解液、蛋白酶K、DNaseⅠ、DNaseⅠBuffer、核酸、提取磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液。其方案在洗涤液I处理步骤后进行DNaseⅠ消化步骤，所述DNaseⅠ浓度为1～3U/μl，为DNaseⅠBuffer包括：终浓度为5～20mmol/L的Tris
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HCl、终浓度为10～50mmol/L的MgCl2，终浓度为0.1～1mmol/L的CaCl2，反应体积为50ul，该反应环境为DNaseⅠ常规反应条件，能够有效去除DNA，但其缺点一是，溶液为水相环境，核酸容易溶解在水相中，导致磁珠吸附时回收效率降低，降低得率；二是反应的体积太小，不利于磁珠法自动化提取的实现。
[0007]综上所列举专利，目前针对RNA提取和纯化的产品还存在如下缺陷：1.大部分采用
胍盐
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有机溶剂法提取高纯度的RNA，但提取过程使用了有毒的有机溶剂，且该方法不适于实现仪器提取自动化。2.有产品不需要使用有机溶剂分离RNA和DNA,其在提取时采用Dnase酶消化DNA，但主要在吸附柱上实现，该方式也是不利于实现仪器提取自动化。3.现有的能够实现仪器自动化的磁珠法提取RNA纯度不够，存在大量DNA污染。有专利提出在该方法提取过程中用Dnase酶消化DNA，但未提供出详尽实施例数据和结果。4.有专利采用合适的Dnase酶反应环境进行消化反应，但因其水相环境会导致核酸磁吸附时回收效率变低，同时，反应的体积小也不适用于磁珠法自动提取操作。因此，需要找到一种磁珠法适用的DNA消化方式，获得高纯度的RNA。这种RNA提取和纯化方法，能够既满足不使用有毒的有机溶剂的要求，同时能够去除DNA残留污染，且轻松实现仪器自动化。

技术实现思路

[0008]临床检测或科学研究中，需要提取高纯度的RNA进行检测，其中DNA污染会干扰下游的检测，既往的研究和产品采用有机溶剂如氯仿对RNA和DNA进行抽提分离，提取的RNA纯度虽然高，但该方式使用有毒的有机试剂，且操作较复杂；或者采用Dnase酶在吸附柱上进行消化处理，从而去除DNA污染，该方式不利于实现仪器自动化提取。
[0009]本专利技术的目的是提供一种磁珠法提取RNA并且能够有效去除DNA的污染。本专利技术采用Dnase酶(脱氧核糖核酸酶)在磁珠法提取过程中进行DNA消化，其反应环境既能满足Dnase酶的最适反应环境需求；同时提供了磁珠吸附时的疏水性环境，保证核酸的得率；还通过加入一种油的乳化液增大提取操作时的总体积，以促进仪器自动化提取操作的便利性。所提取的RNA产量高、纯度高，该方法能够轻松实现仪器自动化提取。解决了临床实际应用过程中快速便捷的提取高纯度RNA的需求，极大地降低了高纯度RNA提取难度和提取成本，所提取的RNA能很好地适应于后续RT
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PCR和RNA
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seq应用。
[0010]本专利技术采用如下技术方案实现：
[0011]一种提取RNA的试剂盒，包括以下组分：蛋白酶K、裂解结合液、磁珠、DNA酶反应液、洗涤液、洗脱液；
[0012]其中DNA酶反应液包括Dnase I、Dnase I buffer,Dnase I buffer包含水相、油相和乳化剂，油相占两相总体积的70％
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90％，优选73
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77％，最优选75％、乳化剂占两相总体积的0.5％
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5％，优选0.5
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2％，最优选1％。
[0013]所述的提取RNA的试剂盒，
[0014]所述油相包括如下组分中的一种或多种：硅油及其衍生物(如二甲基硅油、乙烯基硅油、苯甲基硅油、乙烯基封端聚甲基硅油、聚甲基氢硅氧烷)、氟油及其衍生物(如HFE
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7100、HFE
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7200、HFE
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7500、FC
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40)；所述乳化剂包括如下组分中的一种或多种：非离子表面活性剂(如Span/Triton/Tween)、阴离子表面活性剂(如十二烷基苯磺酸钠、月桂基磺酸钠)、阳离子表面活性剂(十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵)。
[0015]所述的提取RNA的试剂盒，水相中包含PEG。
[0016]所述的提取RNA的试剂盒，水相中含有2.5％
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10％PEG，优选4
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6％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取RNA的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：蛋白酶K、裂解结合液、磁珠、DNA酶反应液、洗涤液、洗脱液；其中DNA酶反应液包括Dnase I、Dnase I buffer,Dnase I buffer包含水相、油相和乳化剂，油相占两相总体积的70％
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90％，优选73
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77％，最优选75％、乳化剂占两相总体积的0.5％
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5％，优选0.5
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2％，最优选1％。2.根据权利要求1所述的提取RNA的试剂盒，其特征在于，所述油相包括如下组分中的一种或多种：硅油及其衍生物、氟油及其衍生物；所述乳化剂包括如下组分中的一种或多种：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂。3.根据权利要求1所述的提取RNA的试剂盒，其特征在于，水相中包含PEG。4.根据权利要求1所述的提取RNA的试剂盒，其特征在于，水相中含有2.5％
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10％PEG，优选4
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6％，最优5％。5.根据权利要求1所述的提取RNA的试剂盒，其特征在于，水相还包含pH缓冲液、1
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5mM MgCl2,优选2
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3mM，最优2.5mM、0.25
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0.75mM CaCl2,优选0.4
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0.6mM，最优0.5mM；所述pH缓冲液包括如下组分中的一种或多种：pH 7.5的10mM
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50mM的NaAc
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HAc缓冲液、pH 7.5的10mM
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50mM的Tris
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HCl缓冲液。6.根据权利要求1所述的提取RNA的试剂盒，其特征在于，DNA酶反应液中Dnase I为40U/
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120U/mL，优选60
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100U/mL，最优选75U/mL。7.根据权利要求1所述的提取RNA的试剂盒，其特征在于，裂解结合液包括如下组分：离液盐、核酸助沉剂、核酸酶抑制剂、还原剂、表面活性剂、异丙醇、pH缓冲液；离液盐包括如下组分中的一种或多种：盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸钠，浓度为3
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6M，进一步优选4
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6M，最优5M；核酸助沉剂包括如下组分中的一种或多种：5％
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20％PEG，进一步优选6％
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12％，最优10％、2
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4M LiCl,进一步优选2.5
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4M，最优3.2M、0.1
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0.5mg/mL Glycogen,进一步优选0.25
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0.5mg/mL，最优0.4mg/mL、2
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10μg/μL Carrier RNA,进一步优选3
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8μg/μL，最优6μg/μL；核酸酶抑制剂包括如下组分中的一种或多种：5mM
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50mM EDTA,进一步优选10mM
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40mM，最优20mM、5mM
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50mM EGTA,进一步优选10mM
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40mM，最优20mM、0.5
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10mM ATA,进一步优选2mM
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8mM，最优5mM、50mM
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200mM甘油醛,进一步优选75mM
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150mM，最优125mM、1mg/ml
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5mg/ml NaF,进一步优选2mg/ml
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4mg/ml，最优3mg/ml；还原剂包括如下组分中的一种或多种：20mM
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200mM三(2
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羧乙基)膦盐酸盐,进一步优选50mM
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150mM，最优125mM、2％
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10％β
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巯基乙醇,进一步优选3％
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8％，最优5％、50
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400mM DTT,进一步优选100mM
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250mM，最优200mM；表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：Tween 20、Triton X
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100、Nonidet P40、Brij35，含量1％
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10％,进一步优选1％
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5％，最优2％、异丙醇含量30
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60％,进一步优选35％
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55％，最优40％；pH缓冲液包括如下组分中的一种或多种：50mM
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250mM pH6.6NaAc
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HAc缓冲液、50mM
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250mM ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐根明，汤链，王永利，刘雅静，冯金儒，贺田芬，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：