本申请涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液。RNA的制备方法包括将原料混合后进行转录反应；原料包括DNA模板、RNA聚合酶、NTPs、含有镁离子的缓冲液以及核酸变性剂；核酸变性剂包括有机溶剂。本申请通过在体外转录反应前的体系中加入核酸变性剂，从转录制备RNA合成端，有效抑制dsRNA的生成，显著提高体外转录后的体系中ssRNA的纯度，从而提高ssRNA的体内稳定性、翻译效率以及降低ssRNA的免疫原性，操作简单。操作简单。操作简单。
【技术实现步骤摘要】
一种RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液
[0001]本申请为分案申请，原申请的申请日为：2021年07月27日；原申请的申请号为：202110848977.9，原申请的专利技术名称为：一种RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液。
[0002]本申请涉及基因工程
，具体而言，涉及一种RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液。
技术介绍
[0003]目前，体外转录(IVT)反应后的体系中含有一定的dsRNA，dsRNA会激发机体自身的防御机制、引起炎症反应以及降低ssRNA作为药物的有效性等。IVT反应后的体系中dsRNA的去除通常是通过LiCl沉淀或醇沉、离子交换色谱柱、硅胶柱等方法提纯，但是上述方法普遍存在纯化后的ssRNA产率较低、ssRNA易被降解以及纯化步骤复杂等缺点。
技术实现思路
[0004]本申请实施例的目的在于提供一种RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液，其旨在改善现有的体外转录反应后的体系中由于含有一定的dsRNA而导致的ssRNA的纯度不高的问题。
[0005]本申请第一方面提供一种RNA的制备方法，RNA的制备方法包括：将原料混合后进行转录反应。
[0006]原料包括DNA模板、RNA聚合酶、NTPs、含有镁离子的缓冲液以及核酸变性剂；核酸变性剂包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂中的至少一种。
[0007]本申请通过在体外转录反应前的体系中加入核酸变性剂，从转录制备RNA合成端，有效抑制dsRNA的生成，显著提高体外转录后的体系中ssRNA的纯度，从而提高ssRNA的体内稳定性、翻译效率以及降低ssRNA的免疫原性，操作简单。
[0008]本申请的第二方面提供一种合成蛋白质的方法，合成蛋白质的方法包括：采用上述第一方面提供的RNA的制备方法制备RNA；然后以RNA为模板合成蛋白质。
[0009]可选地，蛋白质为治疗用途的蛋白质或疫苗用途的蛋白质。
[0010]直接以本申请第一方面提供的RNA的制备方法所制备的RNA为模板合成蛋白质，由于本申请第一方面提供的RNA的制备方法有效抑制了dsRNA的产生使得所制备的RNA中的ssRNA的纯度较高，有利于提高蛋白质的翻译效率。
[0011]本申请的第三方面提供一种转录反应液，转录反应液包括DNA模板、RNA聚合酶、NTPs、含有镁离子的缓冲液以及核酸变性剂；核酸变性剂包括有机溶剂、糖、糖醇、生物碱以及蛋白变性剂中的至少一种。
[0012]可选地，有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、戊醇、聚乙二醇、甲酰胺、1,2,3,4,5
‑
戊五醇、1,2,3,4,5,6
‑
己六醇、丙
‑2‑
烯
‑1‑
醇、3,7
‑
二甲基庚
‑
2,6
‑
二烯
‑1‑
醇、2
‑
丙炔
‑
1
‑
醇、环己烷
‑
1,2,3,4,5,6
‑
六醇、2
‑
(2
‑
丙基)
‑5‑
甲基
‑
环己烷
‑1‑
醇、二甲基亚砜、甲基仲丁基亚砜、正丙基亚砜、正丁基亚砜、四亚甲基亚砜、三乙醇胺以及乙二醇中的至少一种。
[0013]可选地，糖包括海藻糖以及甘露糖中的至少一种。
[0014]可选地，糖醇包括山梨醇以及木糖醇中的至少一种。
[0015]可选地，生物碱包括甜菜碱。
[0016]可选地，蛋白变性剂包括尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚、亚硫酸盐以及硫代硫酸盐中的至少一种。
[0017]可选地，有机溶剂的体积占转录反应液的总体积的百分比为0.1
‑
70.0％。
[0018]可选地，核酸变性剂包括终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的海藻糖、终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的甜菜碱、终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的尿素、终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的异硫氰酸胍、终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的盐酸胍、终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的山梨醇、终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的木糖醇和终摩尔浓度为1.0mM
‑
10.0M的甘露糖中的至少一种；其中，终摩尔浓度为溶质的物质的量与转录反应液的总体积之比。
[0019]可选地，核酸变性剂包括乙醇和尿素；乙醇在转录反应液的总体积的百分比为1.5
‑
15.0％；尿素在转录反应液中的终浓度为40.0mM
‑
1.2M。
[0020]可选地，核酸变性剂包括乙醇、甲酰胺和海藻糖；乙醇与甲酰胺分别占转录反应液的总体积的百分比均为0.5
‑
5.0％；海藻糖在转录反应液中的终浓度为5.0mM
‑
0.5M。
[0021]本申请通过在转录反应液中加入核酸变性剂，从转录制备RNA合成端，有效抑制dsRNA的生成，显著提高体外转录后的体系中ssRNA的纯度，从而提高ssRNA的体内稳定性、翻译效率以及降低ssRNA的免疫原性，操作简单。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0023]图1示出了本申请实施例51
‑
56以及对比例1提供的IVT反应后的dsRNA含量图。
[0024]图2示出了本申请实施例57
‑
59以及对比例1提供的IVT反应后的dsRNA含量图。
[0025]图3示出了本申请实施例51
‑
56以及对比例1提供的小鼠体内IFNα的含量图。
[0026]图4示出了本申请实施例56、59以及对比例1提供的小鼠体内EPO的含量图。
具体实施方式
[0027]为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0028]下面对本专利技术实施例提供的RNA的制备方法、合成蛋白质的方法以及转录反应液进行具体说明。
[0029]在本申请中，单位“M”是指mol/L；“mM”是指mmol/L；ssRNA(single
‑
stranded RNA)
是指单链核糖核酸，dsRN本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种RNA的制备方法，其特征在于，包括：将原料混合后进行转录反应；所述原料包括DNA模板、RNA聚合酶、NTPs、含有镁离子的缓冲液以及核酸变性剂；所述核酸变性剂包括有机溶剂。2.根据权利要求1所述的RNA的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、戊醇、聚乙二醇、甲酰胺、1,2,3,4,5
‑
戊五醇、1,2,3,4,5,6
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己六醇、丙
‑2‑
烯
‑1‑
醇、3,7
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二甲基庚
‑
2,6
‑
二烯
‑1‑
醇、2
‑
丙炔
‑1‑
醇、环己烷
‑
1,2,3,4,5,6
‑
六醇、2
‑
(2
‑
丙基)
‑5‑
甲基
‑
环己烷
‑1‑
醇、二甲基亚砜、甲基仲丁基亚砜、正丙基亚砜、正丁基亚砜、四亚甲基亚砜、三乙醇胺以及乙二醇中的至少一种。3.根据权利要求2所述的RNA的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙醇、甲酰胺以及二甲基亚砜中的至少一种。4.根据权利要求3所述的RNA的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙醇和甲酰胺。5.根据权利要求1所述的RNA的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂占所述原料的总体积的百分比为0.1
‑
70.0％。6.根据权利要求5所述的RNA的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂占所述原料的总体积的百分比为0.5
‑
【专利技术属性】
技术研发人员：何苗，魏民志，
申请(专利权)人：上海兆维生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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