亚磷酰胺化的核苷衍生物及其合成方法、应用和试剂盒技术

一种亚磷酰胺化的核苷衍生物及其合成方法、应用和试剂盒，属于寡聚核苷酸领域。合成方法包括：对起始物的羟基保护，碱基上的N6位氨基进行保护，然后脱除3

【技术实现步骤摘要】
亚磷酰胺化的核苷衍生物及其合成方法、应用和试剂盒


[0001]本申请涉及寡核苷酸领域，具体而言，涉及一种亚磷酰胺化的核苷衍生物及其合成方法、应用和试剂盒。

技术介绍

[0002]迄今为止，对于癌症、病毒性感染等疾病，临床上仍缺少理想的特效药物。可喜的是，随着人类及重要模式生物基因组测序的完成，以及功能基因组学及蛋白质组学研究的深入，与疾病相关的分子靶标不断被发现和认识，为基因治疗提供了前提。
[0003]在过去的几十年里，人工合成的寡核苷酸已经广泛应用于靶向基因治疗的研究。寡聚核苷酸主要包括反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides,ASODN)、小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)、转录因子诱饵(Decoy)、核酶(Ribozyme)、脱氧核酶(DNAzyme)、反基因(Antigene)、CpG寡核苷酸和核酸适配体(Aptamer)等。其中，ASODN和siRNA是最常用的基因调控工具，获得广泛应用，并已被开发为基因治疗药物。
[0004]目前，寡核苷酸主要采用化学方法合成。当前的化学合成工艺存在初产品纯度低，难以纯化，大量制备成本十分高昂，极大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。

技术实现思路

[0005]本申请提供了一种亚磷酰胺化的核苷衍生物及其合成方法、应用和试剂盒。该合成方法方便实施，且实施成本低，利于大规模生产。
[0006]本申请是这样实现的：
[0007]在第一方面，本申请的示例提供了一种亚磷酰胺化的核苷衍生物的合成方法。其以腺嘌呤2
′‑
脱氧核苷为起始物，经过基团保护、脱保护以及修饰目标基团而实现。
[0008]合成方法包括：
[0009]步骤1：对起始物的3
′
和5
′
羟基保护，再对碱基上的N6位氨基进行保护，然后脱除3
′
和5
′
羟基的保护基团，获得第一中间体；
[0010]步骤2：依次对第一中间体的5
′
和3
′
羟基进行保护，获得第二中间体；
[0011]步骤3：脱除第二中间体的5
′
羟基的保护基团，并通过甲氧基异丙基对5
′
羟基进行保护，获得第三中间体；
[0012]步骤4：依次脱除第三中间体中的3
′
羟基的保护基团和碱基上的N6位氨基的保护基团，获得第四中间体；
[0013]步骤5：依次对第四中间体的碱基上的N6位氨基进行亚胺化保护，3
′
羟基进行亚磷酰胺化保护，获得亚磷酰胺化的核苷衍生物。
[0014]在第二方面，本申请示例提出了一种亚磷酰胺化的核苷衍生物，衍生物具有下述结构：
[0015][0016]在第三方面，本申请示例提出了一种亚磷酰胺化的核苷衍生物在合成反义寡聚核苷酸中的应用。
[0017]在第四方面，本申请示例提出了一种试剂盒，含有前述的亚磷酰胺化的核苷衍生物或其制成品。
[0018]在以上实现过程中，本申请实施例提供的合成方法具有工艺过程简单易于实施的特点。并且，该合成方法各步骤中的产物纯度高、易于纯化，且实施成本低，利于大量生产。
[0019]此外，本申请的示例合成方法还至少具有以下一些优点：
[0020]1、本申请提供的制备方法初始原料为脱氧腺嘌呤核苷，来源广泛，经济易得。
[0021]2、本申请提供的制备方法无需特殊设备，操作简单方便，适合大规模工业化生产。
[0022]3、本申请提供的制备方法仅仅只需要结晶和硅胶纯化就能得到高纯度的核苷亚磷酰胺，具有良好的工业应用价值。
具体实施方式
[0023]核苷亚磷酰胺是用于合成寡核苷酸的天然或合成核苷的衍生物。通常而言，当核苷或其类似物中含有至少一个羟基时，通过使用适当的基团保护策略就可以将核苷或其类似物转化成各自的亚磷酰胺。并且，后续可以以此亚磷酰胺化的核苷或其类似物为原料，通过反应而者并入合成的核酸中。
[0024]亚磷酰胺的一个重要特征是它们在酸性催化剂存在下进行亚磷酰胺偶联反应的能力。这使得核苷亚磷酰胺成为在寡核苷酸合成中有用的中间体。因此，在寡核苷酸领域中，迫切需要适合大规模生产修饰性核苷亚磷酰胺的合成技术。
[0025]有鉴于此，本申请专利技术人，在本申请中提出了一种亚磷酰胺化的核苷衍生物的合成方法。示例中，该衍生物是核苷亚磷酰胺；更具体而言，其是5'
‑
O
‑2‑
MIP(甲氧基丙基)保护的腺嘌呤脱氧核苷亚磷酰胺，且具有如下述式a的结构。
[0026]其中的Me表示甲基。
[0027]根据上述可知，该衍生物以腺嘌呤脱氧核苷酸为主体，且分别对腺嘌呤的碱基上的胺进行保护，核糖的3'羟基进行了亚磷酰胺化，核糖的5'羟基进行了保护。
[0028]因此，该衍生物可以作为制作其他核苷酸的中间体被使用。换言之，在本申请中，专利技术人提出了一种新的中间体，其可以被用于合成核苷酸。其中，碱基上的氨基保护和5'羟基保护都可以方便地在合成核苷酸的过程中予以脱除。而3'羟基的亚磷酰胺化则可以用以构成核苷酸中的磷酸二酯键。例如，一些二聚核苷酸中，两个核糖的3'碳和5'碳通过磷酸二酯键连接。因此，该化合物a可以作为合成反义寡聚核苷酸中的原料中间体。除此之外，其还可以被用于制作试剂盒。在该试剂盒中，化合物a可以是衍生物—即其制成品—形式存在。
[0029]在化学合成中，尤其是核苷酸领域，可以通过采用各种中间体来缩短合成路径、简化合成方法。但是，这些方案中往往需要特殊的中间体，从而导致工艺成本非常高，或者说由于中间体的结构特殊性导致产物的收率很低、杂质含量较高。
[0030]有鉴于这样的显示状况，在本申请示例中，以基础的腺嘌呤脱氧核苷为起始物通过巧妙地选择合成路径，以期望的优势获得了目标产物(前述a式化合物)。
[0031]其中的，起始物具有下述式b所示的结构。
[0032]其中的核糖单元为2'
‑
脱氧核糖。
[0033]换言之，本申请示例中的一个目标是通过起始物b合成衍生物a，如下所示。
[0034][0035]因此，从合成路径上而言，可以对N6位上的氨基的亚胺化保护(第一处理)、3'羟基的亚磷酰胺化(第二处理)和5'羟基的保护(第三处理)通过在不同的步骤中进行保护和脱保护，从而实现独立地对上述三个基团进行分别修饰。即通过基团保护和脱保护的方式，就N6位上的氨基、3'羟基和5'羟基而言，将需要进行处理的基团独自“暴露”，而将暂时不需要处理的基团进行“掩蔽”(通过保护基团将其沉默)。如此，被“暴露”的基团能够进行需要的反应处理(即第一处理，或第二处理，或第三处理)。
[0036]因此，基于上述的合成思路，例如，一些可能的选择如下。
[0037]第一选择：先实施第一处理，然后，再实施第二处理，其次实施第三处理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚磷酰胺化的核苷衍生物的合成方法，其特征在于，以腺嘌呤2
′‑
脱氧核苷为起始物，经过基团保护、脱保护以及修饰目标基团而实现；所述合成方法包括：步骤1：对所述起始物的3
′
和5
′
羟基保护，再对碱基上的N6位氨基进行保护，然后脱除3
′
和5
′
羟基的保护基团，获得第一中间体；步骤2：依次对所述第一中间体的5
′
和3
′
羟基进行保护，获得第二中间体；步骤3：脱除所述第二中间体的5
′
羟基的保护基团，并通过甲氧基异丙基对5
′
羟基进行保护，获得第三中间体；步骤4：依次脱除所述第三中间体中的3
′
羟基的保护基团和碱基上的N6位氨基的保护基团，获得第四中间体；步骤5：依次对所述第四中间体的碱基上的N6位氨基进行亚胺化保护，3
′
羟基进行亚磷酰胺化保护，获得所述亚磷酰胺化的核苷衍生物。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，在步骤5中，对所述第四中间体的碱基上的N6位氨基进行亚胺化保护采用的保护试剂为缩醛，可选地，缩醛的用量为第四中间体摩尔量的2倍至10倍；或者，在步骤3中，通过甲氧基异丙基对3
′
羟基进行保护是通过酸催化二甲基丙基与脱除3
′
羟基的保护基团的第二中间体反应而实现；可选地，所述酸包括硫酸、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银或三氟甲磺酸钪，且酸与第二中间体的摩尔比为1:100至10:100。3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，在步骤1中，3
′
和5
′
羟基通过硅烷化试剂进行保护；可选地，所述硅烷化试剂包括TMS
‑
Cl，TBDMS
‑
Cl，TBDPS
‑
Cl和TIPS
‑
Cl2中的任意一种或多种组合，且硅烷化试剂是在催化剂的存在下进行反应的，其中的催化剂包括吡啶，二氯甲烷和三乙胺的混合物，或乙腈和三乙胺的混合物，且催化剂和所述起始物的液料比为4至10；可选地，脱除由所述硅烷化试剂形成的保护基团的脱保护试剂包括四丁基氟化铵，三乙胺三氢氟酸盐，或氟化氢吡啶溶液，且起始物与脱保护试剂的摩尔比为1:2.0至1:5.0；或者，在步骤1中，碱基上的N6位氨基进行保护的基团来自于酰氯，所述酰氯包括AcCl，BzCl，PacCl或FmocCl，且酰氯与所述起始物的摩尔比为1:1.05至1:1.50；可选...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晨，李文强，陈哲贤，刘建新，黄银军，杨阳，姚峰，
申请(专利权)人：上海兆维生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：