一种亲和层析填料及其制备方法以及亲和纯化工艺技术

本申请涉及生物大分子分离纯化技术领域，具体而言，涉及一种亲和层析填料及其制备方法以及亲和纯化工艺。亲和层析填料包括活化后的载体以及连接于活化后的载体上的配体。本申请提供的亲和层析填料通过将含有锁核酸结构以及氨基基团的配体连接至活化后的载体上，可以有效对目的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶进行分离纯化，有效提高纯化后的目的蛋白的收率以及纯度。目的蛋白的收率以及纯度。目的蛋白的收率以及纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种亲和层析填料及其制备方法以及亲和纯化工艺


[0001]本申请涉及生物大分子分离纯化
，具体而言，涉及一种亲和层析填料及其制备方法以及亲和纯化工艺。

技术介绍

[0002]氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶可以用于转录合成RNA，目前氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶的制备一般是通过设计含有相应氨基酸突变位点的密码子引物，在PCR反应体系中，通过聚合酶链式反应扩增含有正确突变序列的T7RNA聚合酶的基因序列，再利用表达菌体表达所需的突变的T7RNA聚合酶。
[0003]但是，表达菌体的表达体系复杂，所表达的聚合酶不仅包含所需的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶，还包括其他未良好表达的非目的蛋白。目前，对上述体系的纯化以获得目的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶的纯化方法复杂，且目的蛋白的得率和纯度都不高，不利于目的蛋白的工业化放大生产和进一步应用。

技术实现思路

[0004]本申请的目的在于提供一种亲和层析填料及其制备方法以及亲和纯化工艺，其旨在改善现有的获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶的得率和纯度均不高的技术问题。
[0005]本申请第一方面提供一种亲和层析填料，包括活化后的载体以及连接于活化后的载体上的配体；配体的结构式如下：
[0006][0007]其中，B为天然的或修饰的含有氨基的核苷碱基。
[0008]本申请提供的亲和层析填料通过将含有锁核酸结构以及氨基基团的配体连接至活化后的载体上，可以有效对目的蛋白含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶进行分离纯化，有效提高纯化后的目的蛋白的收率以及纯度。
[0009]本申请第二方面提供一种亲和层析填料的制备方法，包括将上述第一方面提及的
配体与活化后的载体进行偶联反应；活化后的载体的制备方法包括采用活化剂对载体进行活化处理。
[0010]采用上述方法制备得到的亲和层析填料用于对目的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶进行纯化分离时，可有效提高纯化后的目的蛋白的收率以及纯度。
[0011]本申请第三方面提供一种亲和纯化工艺，包括采用放置有如上述第一方面提供的亲和层析填料的亲和层析柱对含有目的蛋白的体系进行纯化处理；目的蛋白包括突变的T7RNA聚合酶，突变的T7RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
[0012]采用上述亲和纯化工艺对目的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶进行纯化分离时，可有效提高纯化后的目的蛋白的收率以及纯度，操作简单，易于工业化放大生产。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0014]图1示出了本申请实施例1中亲和纯化工艺得到的含有目的蛋白的产物的凝胶电泳图。
[0015]图2示出了本申请实施例2中SP Sepharose Fast Flow阳离子层析得到的洗脱样品的凝胶电泳图。
[0016]图3示出了本申请实施例3中磷酸纤维素层析得到的洗脱样品的凝胶电泳图。
具体实施方式
[0017]为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0018]下面对本申请实施例提供的一种亲和层析填料及其制备方法以及亲和纯化工艺进行具体说明。
[0019]本申请提供一种亲和层析填料，包括活化后的载体以及连接于活化后的载体上的配体；配体的结构式如下：
[0020][0021]其中，B为天然的或修饰的含有氨基的核苷碱基。
[0022]需要说明的是，上述配体结构式中的B可以为天然的含有氨基的核苷碱基，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤以及胞嘧啶等；上述配体结构式中的B也可以为修饰的含有氨基的核苷碱基，例如，氨基取代的尿嘧啶、氨基取代的腺嘌呤、氨基取代的鸟嘌呤以及氨基取代的胞嘧啶等。
[0023]配体结构中核糖上2'
‑
O
‑
和4'
‑
C
‑
位之间通过亚甲基基团桥接，形成“锁核酸”结构。
[0024]可以理解的是，只要满足上述结构式限定的物质，均属于本申请可选的配体。
[0025]通过将含有锁核酸结构以及氨基基团的配体连接至活化后的载体上制得亲和层析填料，可以有效对目的蛋白含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变的T7RNA聚合酶进行分离纯化，有效提高纯化后的目的蛋白的收率以及纯度。
[0026]在本实施例中，配体可以选自商品化的LNA
‑
ATP、LNA
‑
GTP或LNA
‑
UTP，上述物质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亲和层析填料，其特征在于，包括活化后的载体以及连接于所述活化后的载体上的配体；所述配体的结构式如下：其中，B为天然的或修饰的含有氨基的核苷碱基。2.根据权利要求1所述的亲和层析填料，其特征在于，所述配体选自LNA
‑
ATP、LNA
‑
GTP或LNA
‑
UTP；可选地，所述载体选自琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、多孔硅胶或纤维素。3.如权利要求1或2所述的亲和层析填料的制备方法，其特征在于，包括将所述配体与所述活化后的载体进行偶联反应。4.根据权利要求3所述的亲和层析填料的制备方法，其特征在于，所述活化后的载体的制备方法包括采用活化剂对所述载体进行活化处理；所述活化剂选自溴化氰、环氧基材料以及戊二醛中的任意一种；可选地，所述环氧基材料选自环氧氯丙烷。5.根据权利要求3所述的亲和层析填料的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的pH为8.0
‑
9.0；可选地，所述偶联反应的pH为8.3。6.根据权利要求3所述的亲和层析填料的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为4
‑
8℃，所述偶联反应的时间为12
‑
16h；可选地，所述偶联反应的温度为4℃，所述偶联反应的时间为12h。7.一种亲和纯化工艺，其特征在于，包括采用放置有如权利要求1或2所述的亲和层析填料的亲和层析柱对含有目的蛋白的体系进行纯化处理；所述目的蛋白包括突变的T7RNA聚合酶，所述突变的T7RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。8.根据权利要求7所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述纯化处理包括将含有所述目的蛋白的体系的结合平衡缓冲液上样至所述亲和层析柱，采用淋洗洗杂缓冲液进行清洗，采用梯度洗脱缓冲液进行洗脱；其中，所述结合平衡缓冲液包括第一缓冲剂、第一螯合剂、第一还原剂以及第一稳定剂；所述淋洗洗杂缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱剩金，陈丽，杨侠斐，
申请(专利权)人：上海兆维生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：